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常磁性プローブを利用した準安定な複合体の立体構造解析

公募研究

研究領域過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解-生理的準安定状態を捉える新技術-
研究課題/領域番号 24121722
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関首都大学東京

研究代表者

三島 正規  首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
研究課題ステータス 完了 (2013年度)
配分額 *注記
11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円)
2013年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2012年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
キーワード常磁性 / NMR / 構造解析 / 複合体
研究概要

1. SPOCドメインによるリン酸化SMRTの分子認識
転写抑制補因子SHARP(SMRT/HDAC-associated repressor protein)は、そのSPOCドメインにおいて転写抑制補因子SMRT/NcoRと相互作用することで、HDACをリクルートし、転写を抑制する。現在までに本領域における取り組みで、SPOCドメイン/リン酸化SMRT複合体の立体構造を決定し、SPOCドメインの変異体を用いた結合実験をSPRを用いて行うことにより、その分子認識機構を明らかにしていた。我々はさらにluciferaseによるレポーターアッセイをCV-1細胞を用いて行った。その結果、SPRからリン酸基の分子認識に重要であることがわかっていたR3552とK3516の変異体では顕著に転写抑制能が落ちることが明らかとなった。このことから、実際に細胞内でも、構造解析やSPRによって明らかにされたものと同様の分子認識メカニズムでリン酸基が認識され、複合体が形成されていると考えることができる。また各変異体の細胞内局在はすべて核内であることも確認した。
2. PKC全長の構造解析
Protein kinase C a (PKCa)は極めて多くの生命現象、疾患に関与することが知られている。しかしながら、各ドメイン間の相互作用が弱く、それらが柔らかなリンカーで結ばれているため、全長での構造解析には至っていない。C1Aドメインについては当初まったく可溶画分で発現しなかったが、コンストラクションを工夫することで、大腸菌からの調製を可能にし、その立体構造を決定した。また、収量は非常に少なかったが、sortase Aを用いてキナーゼドメインとライゲーションし、全長のPKCの再構成に向けて進展が得られた。

現在までの達成度 (区分)
理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2013 実績報告書
  • 2012 実績報告書
  • 研究成果

    (21件)

すべて 2014 2013 2012

すべて 雑誌論文 (12件) (うち査読あり 12件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 1件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Structural insights into the recruitment of SMRT by the corepressor SHARP under phosphorylative regulation.2014

    • 著者名/発表者名
      Mikami S, Kanaba T, Takizawa N, Kobayashi A, Maesaki R, Fujiwara T, Ito Y,Mishima M.
    • 雑誌名

      Structure.

      巻: 22 号: 1 ページ: 35-46

    • DOI

      10.1016/j.str.2013.10.007

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Microtubule-binding sites of the CH domain of EBl and its autoinhibition revealed by NMR.2013

    • 著者名/発表者名
      Kanaba T, Maesaki R, Mori T, I to Y, Hakoshima T, Mishima M.
    • 雑誌名

      Biochim Biophys Acta.

      巻: 1834 号: 2 ページ: 499-507

    • DOI

      10.1016/j.bbapap.2012.10.013

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins living insect cells using a baculovirus protein expression system ≪2013

    • 著者名/発表者名
      Jumpei Hamatsu, Daniel O'Donovan, Takashi Tanaka, Takahiro Shirai, Yuichiro Hourai, Tsutomu Mikawa, Teppei Ikeya, Masaki Mishima, Wayne Boucher, Brian O. Smith, Ernest D. Laue, Masahiro Shirakawa, Yutaka Ito 4
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 135 号: 5 ページ: 1688-1691

    • DOI

      10.1021/ja310928u

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Divergent DNA-binding specificities of a group of ETHYLENE RESPONSE FACTOR transcription factors involved in plant defense.2013

    • 著者名/発表者名
      Shoji T, Mishima M, Hashimoto T.
    • 雑誌名

      Plant Physiol.

      巻: 162 号: 2 ページ: 977-990

    • DOI

      10.1104/pp.113.217455

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structure of the second RRM domain of Nrd1, a fission yeast MAPK target RNA binding protein, and implication for its RNA recognition and regulation.2013

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi A, Kanaba T, Satoh R, Fujiwara T, Ito Y, Sugiura R, Mishima M.
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun.

      巻: 437 号: 1 ページ: 12-17

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2013.06.008

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration in HeLa cells2013

    • 著者名/発表者名
      Dambarudhar Shiba Sankar Hembrama, Takahiro Haremakia, Jumpei Hamatsua, Jin Inouea, Hajime Kamoshidaa, Teppei Ikeyaa, Masaki Mishimaa, Tsutomu Mikawab, Nobuhiro Hayashic, Masahiro Shirakawad, Yutaka Ito
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun

      巻: 438 号: 4 ページ: 653-659

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2013.07.127

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins in living insect cells using a baculovirus protein expression system.2013

    • 著者名/発表者名
      Hamatsu J,
    • 雑誌名

      J Am Chem Soc.

      巻: 135 ページ: 1688-91

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Microtubule-binding sites of the CH domain of EB1 and its autoinhibition revealed by NMR2013

    • 著者名/発表者名
      Kanaba, T.
    • 雑誌名

      Biochimica et Biophysica Acta

      巻: 1834 ページ: 499-507

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] NMR assignments of SPOC domain of the human transcriptional corepressor SHARP in complex with a C-terminal SMRT peptide2012

    • 著者名/発表者名
      Mikami S
    • 雑誌名

      Biomolecular NMR Assignments

      巻: in press

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] “Insights into substrate recognition by the Escherichia coli Orf135 protein through its solution structure2012

    • 著者名/発表者名
      Kawasaki, K
    • 雑誌名

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      巻: 420 ページ: 263-268

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] H, 13C and 15N NMR Assignments of the Escherichia coli Orf135 protein2012

    • 著者名/発表者名
      Kawasaki, K
    • 雑誌名

      Biomolecular NMR Assignments

      巻: 6 ページ: 1-4

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] メチルTROSY法を用いた巨大生体高分子のNMR解析と構造生物学への応用2012

    • 著者名/発表者名
      三島正規
    • 雑誌名

      分光研究

      巻: 5 ページ: 194-195

    • NAID

      10031079566

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] RNA結合蛋白質 Nrd1の NMR法による構造解析2013

    • 著者名/発表者名
      小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
    • 学会等名
      第13回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      鳥取
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] NMRを用いた溶液中のマルチドメインタンパク質 PKCの構造解析の試み2013

    • 著者名/発表者名
      金場哲平, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
    • 学会等名
      第13回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      鳥取
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] 分裂酵母由来の MAP キナーゼによりリン酸化される RNA 結合タンパク質 Nrd1 の構造解析2013

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi A., Satoh R., Fujiwara T., Sugiura R., Ito Y., Mishima M
    • 学会等名
      第 51 回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      京都
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] MAPキナーゼによりリン酸化されるRNA結合タンパク質Nrd1の構造解析2013

    • 著者名/発表者名
      小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
    • 学会等名
      第52回 NMR討論会
    • 発表場所
      金沢
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] マルチドメインタンパク質Protein kinase Cの構造解析の試み2013

    • 著者名/発表者名
      金場哲平, 矢巻菜央, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
    • 学会等名
      第52回 NMR討論会
    • 発表場所
      金沢
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] 転写抑制補因子SHARP/SMRT複合体の溶液構造とCK2によるSMRTのリン酸化2012

    • 著者名/発表者名
      三島 正規
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2012-12-11
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] NMRによるマルチドメインタンパク質PKCの構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      秋吉 克昂
    • 学会等名
      第51回NMR討論会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      2012-11-08
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] 転写因子IRF4 の溶液構造の解析2012

    • 著者名/発表者名
      榊 航平
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      2012-06-20
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [図書] 細胞工学 (転写抑制補助因子のcasein kinase 2によるリン酸化と転写制御)2014

    • 著者名/発表者名
      小林彩保、金場哲平、三島正規
    • 出版者
      学研メディカル秀潤社
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書

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公開日: 2013-05-15   更新日: 2019-07-29  

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