| 研究領域 | 翻訳後修飾によるシグナル伝達制御の分子基盤と疾患発症におけるその破綻 |
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| 研究課題/領域番号 |
25117710
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
山本 一夫 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2014年度)
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| 配分額 *注記 |
7,540千円 (直接経費: 5,800千円、間接経費: 1,740千円)
2014年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2013年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
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| キーワード | 糖鎖修飾 / 翻訳後修飾 / N-アセチルグルコサミン |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、N-アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするcDNAをHEK293細胞の細胞質や核内に発現させて、核内及び細胞質タンパク質に見出されるN-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾を伸長させることを行い、また、この伸長させた糖鎖に特異的に結合する新規のレクチンを見出した。これらの系を用いて、細胞質及び核内の新規のO-GlcNAc修飾タンパク質を特定したが、これらの糖鎖修飾が、どのアミノ酸残基に伸長した糖鎖が付加されているかについて詳細に検討した。修飾残基が1箇所知られているc-Relタンパク質をモデルとして、Mycタグを付加したc-Rel cDNAを上記のHEK293細胞に発現させ、免疫沈降してウエスタンブロッティングを行うと、GalNAc-GlcNAcに特異的なWJAへの結合が上昇し、抗O-GlcNAc抗体への結合は低下した。また、2次元電気泳動後、c-Relのスポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、回収したペプチドをMALDI-TOF質量分析で解析したところ、既知のSer残基が確かに2糖に伸長していることが示された。また、WJAレクチンを用いたアフィニティクロマトグラフィーで糖修飾ペプチドを特異的に精製することを試みたところ、GlcNAc修飾のみのペプチドに比べて2糖の方がレクチンに対する親和性が大きく亢進するため、効率よい濃縮が可能であると思われた。O-GlcNAc修飾のイメージングに関しては、WGAレクチンをGFP融合タンパク質として細胞質内に発現させることを行った。細胞活性化時における変化は、自家蛍光を排除するための対照とするレクチンが必要であり、今後の検討課題である。
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| 現在までの達成度 (段落) |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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