トップダウンリン酸化プロテオミクスを指向したアフィニティー磁気ビーズの創出

• 研究領域: 翻訳後修飾によるシグナル伝達制御の分子基盤と疾患発症におけるその破綻
• 研究課題/領域番号: 25117718
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 木下 英司 広島大学, 医薬保健学研究院(薬), 准教授 (80304418)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 10,660千円 (直接経費: 8,200千円、間接経費: 2,460千円); 2014年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円); 2013年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
• キーワード: フォスタグ / リン酸化 / プロテオーム / 翻訳後修飾 / マグネットビーズ

研究実績の概要

これまでに申請者は，リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）をクロマト単体であるアガロースビーズに固定化させた分離剤を開発している。しかしながらこの分離剤は，迅速性と簡便性の点で課題を残していた。本研究では，迅速性や簡便性において特に優れたマグネット技術とフォスタグ技術を融合させることで従来の課題を解決する。当該年度では，前年度に合成した新規リン酸親和性磁気ビーズを利用することにより，分析ターゲットの絞り込みがなされ，リン酸化プロテオーム解析がいっそう容易，かつ，迅速になることを想定しながら以下の検討項目を実施した。
１）リン酸化プロテオーム解析を行うための緩衝液系の決定：リン酸親和性磁気ビーズに亜鉛を十分に結合させる平衡緩衝液として，0.1 M 酢酸亜鉛を含む 0.1 M Bis-Tris-AcOH (pH 7）を使用した。サンプルを結合させ，洗浄する緩衝液として，0.1 M 酢酸ナトリウムを含む 0.1 M Bis-Tris-AcOH (pH 7）を使用した。サンプルを溶出させる緩衝液として，0.1 M ピロリン酸ナトリウム-AcOH（pH 7）を使用した。
２）リン酸化プロテオーム解析の実行：OVISE 細胞のショットガンペプチドを上記の緩衝液系を利用して精製，濃縮を行った。精製濃縮されたペプチド 3.75 μg を質量分析により測定した結果，同定ペプチド数（850以上），並びに同定リン酸化率（90%以上）ともに従来のフォスタグアガローズビーズ法と比較してほぼ同様であることがわかった。さらには，その作業工程に関して，従来法よりも最大で60分以上短縮できることが明らかとなった。
以上のことより，新規リン酸親和性磁気ビーズを用いた本手法が，従来法より迅速性や簡便性において優れていることが証明でき，リン酸化プロテオーム解析にも十分に応用できることが示唆された。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The cutting edge of affinity electrophoresis technology (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomes 巻: 3 号: 1 ページ: 42-55
  • DOI: 10.3390/proteomes3010042
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Neutral phosphate affinity SDS-PAGE system for profiling of protein phosphorylation (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: Methods Mol. Biol. 巻: 1295 ページ: 323-354
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2550-6_24
  • ISBN: 9781493925490, 9781493925506
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Profiling of Protein Thiophosphorylation Using Phos-tag Affinity Electrophoresis: Evaluation of Adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a Phosphoryl Donor in Protein Kinase Reactions (2014)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, A. Shiba, K. Edahiro, Y. Inoue, K. Yamamoto, and T. Koike
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 14 号: 6 ページ: 668-679
  • DOI: 10.1002/pmic.201300533
  • 査読あり
• [雑誌論文] Simple enrichment of thiol- containing biomolecules by using zinc(II)-cyclen-functionalized magnetic beads (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, H., Tsunehiro, M., Kawaguchi, M., Kuramoto, Y., Kurosaki, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Sep. Sci. 巻: 37 号: 13 ページ: 1601-1609
  • DOI: 10.1002/jssc.201400135
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of cAMP-dependent phosphorylated proteins involved in the formation of environment-resistant resting cysts by the terrestrial ciliate Colpoda cucullus (2014)
  • 著者名/発表者名: Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, and Matsuoka, T.
  • 雑誌名: Invert. Surviv. J. 巻: 11 ページ: 213-218
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Phos-tag-based fluorescence quenching system for activity assay and inhibitor screening for alkaline phosphatase (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Kurosaki, H., Kunisada, N., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: Am. J. Anal. Chem. 巻: 5 号: 12 ページ: 796-804
  • DOI: 10.4236/ajac.2014.512088
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Tips on improving the efficiency of electrotransfer of target proteins from Phos-tag SDS-PAGE gel (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Matsuda, A., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 14 号: 21-22 ページ: 2437-2442
  • DOI: 10.1002/pmic.201400380
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of two phosphorylated species of β-catenin involved in the ubiquitin-proteasome pathway by using two-dimensional Phos-tag affinity electrophoresis (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Electrophoresis 巻: 58 ページ: 1-4
  • NAID: 130004713130
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Advances in Phos-tag-based methodologies for separation and detection of the phosphoproteome (2014)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta. 巻: 1854 ページ: 601-608
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] アフィニティー電気泳動技術の最前線 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池 透
  • 雑誌名: ぶんせき 巻: 7 ページ: 365-371
  • NAID: 40020143674
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Phos-tag 電気泳動 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 雑誌名: 電気泳動 -生物物理化学- 巻: 58 ページ: 21-23
  • NAID: 130004704676
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of differentially expressed water-insoluble proteins in the encystment process of Colpoda cucullus by two-dimensional electrophoresis and LC-MS/MS analysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sopme, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Kinoshita, E., Matsuoka, T.
  • 雑誌名: J. Eukaryot. Microbiol. 巻: 61 号: 1 ページ: 51-60
  • DOI: 10.1111/jeu.12086
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules (2013)
  • 著者名/発表者名: M. Tsunehiro, Y. Meki, K. Matsuoka, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita and T. Koike
  • 雑誌名: Journal of Chromatography B 巻: 925 ページ: 86-94
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2013.02.039
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag (2013)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: 438 号: 2 ページ: 104-106
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.03.029
  • 査読あり
• [雑誌論文] Excystment-dependent alteration of protein expression in terrestrial ciliate Colpoda cucullus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, Funadani, R., and Matsuoka, T.
  • 雑誌名: Microbes Environ. 巻: 28 ページ: 388-390
  • NAID: 10031191423
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increase in Lipophilicity of Enalaprilat by Complexation with Copper(II) or Zinc(II) Ions. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, H., Hieda, Y., Kuramoto, Y, Konishi, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike T.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi 巻: 33 ページ: 1135-1141
  • NAID: 130003361996
  • 査読あり
• [雑誌論文] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開． (2013)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 雑誌名: 生化学 巻: 85 ページ: 447-552
  • NAID: 10031184265
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phos-tag-Based Microarray Techniques Advance Phosphoproteomics (2013)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta and Tohru Koike
  • 雑誌名: Journal of Proteomics & Bioinformatics 巻: S6 号: S6 ページ: 8-8
  • DOI: 10.4172/jpb.s6-008
  • 査読あり
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGE ゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる秘訣 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-11-25
• [学会発表] 銅および亜鉛キレート形成によるACE阻害剤エナラプリラトの脂溶性増加 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小西華那世，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第65回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-10-25
• [学会発表] SuperSep Phos-tag を用いた低分子量リン酸化タンパク質の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 脇本理恵子，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第65回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-10-25
• [学会発表] Phos-tag 電気泳動 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 第65回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-10-24
  • 招待講演
• [学会発表] Development of protein kinase-responsive system based on peptide- conformational change (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuta Nakamura, Sato Hikari, Tahara Yu, Yamamoto Tatsuhiro, Kishimura Akihiro, Mori Takeshi, Kinoshita Eiji, Koike Tohru and Katayama Yoshiki
  • 学会等名: The 15th IUMRS-International Conference in Asia
  • 発表場所: 福岡市
  • 年月日: 2014-08-24 – 2014-08-30
• [学会発表] 亜鉛の特性を利用したライフイノベーション (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 第8回 レドックス・ライフイノベーション第170委員会 & 第3回 JHUPO サテライト ジョイントシンポジウム
  • 発表場所: 宮崎市
  • 年月日: 2014-08-22
  • 招待講演
• [学会発表] チオール含有生体分子を分離・濃縮するための亜鉛サイクレン磁気ビーズの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 河口真歩，Yuan Tianfei Elena，藤岡晴人，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2014年会
  • 発表場所: つくば市
  • 年月日: 2014-07-18
• [学会発表] リン酸化プロテオミスのための Phos-tag テクノロジー：サンプル前処理技術としての貢献 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 第41回 BMS コンファレンス
  • 発表場所: 石川県羽咋郡
  • 年月日: 2014-07-08
  • 招待講演
• [学会発表] トップダウンリン酸化プロテオミクスを指向したアフィニティー磁気ビーズの創出 (2013)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 「修飾シグナル病」 第３回領域推進会議
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 愛媛大学プロテオサイエンスセンター & JHUPO サテライト ジョイントシンポジウム（第２回）
  • 発表場所: 愛媛大学総合情報メディアセンター，松山市
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代シグナル伝達研究のためのフォスタグテクノロジー
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 第86回日本生化学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phos-tag Biotin as an on-demand tool for study on protein phosphorylome
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phosphorylation profiling of MAPK signaling cascade proteins by using neutral Phos-tag SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules by using a Phos-tag-based magnetic-bead method
  • 著者名/発表者名: Masaya Tsunehiro, Yuma Meki, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of effects of pH on the stability of His- and Asp-phosphoproteins in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Akio Shiba, Keisuke Edahiro, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of the phosphorylation state of a hybrid histidine kinase in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Keisuke Edahiro, Akio Shiba, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yuki Inoue, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phos-tag-Based Technological Advances for Studies on Signal Transductions in the Coming Generation
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
  • 招待講演
• [学会発表] Ras/MAPK症候群および孤発性癌で認められるMEK遺伝子変異体の 異常活性化機構と疾患発症メカニズムの解明
  • 著者名/発表者名: 久保田 裕二，木下 英司，武川 睦寛
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するための Phos-tag磁気ビーズの開発
  • 著者名/発表者名: 常弘 昌弥, 目木 勇馬, 木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ヒスチジン，アスパラギン酸のタンパク質リン酸化解析におけるチオリン酸基供与体（ATP-gS）利用の有用性の検討
  • 著者名/発表者名: 芝 晃生，枝廣 圭祐，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構解析
  • 著者名/発表者名: 枝廣 圭祐，芝 晃生，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 近接Phos-tagゲルを用いたリン酸化タンパク質の電気泳動法
  • 著者名/発表者名: 目木 勇馬，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag磁気ビーズの創製
  • 著者名/発表者名: 常弘昌弥, 目木勇馬, 木下恵美子，木下英司, 小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおける リン酸基転移反応の制御機構
  • 著者名/発表者名: 枝廣圭祐, 芝 晃生, 井上裕希，木下恵美子, 木下英司，小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] Highly Sensitive Detection of Protein Phosphorylation by Phos-tag Technology
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita
  • 学会等名: 1st HiHA International Symposium
  • 発表場所: Hiroshima University, Higashi-Hiroshima
  • 招待講演
• [学会発表] Phos-tag を用いた解析技術
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー ～キナーゼ・シグナリング研究の進展～
  • 発表場所: 大阪大学蛋白質研究所，吹田市
  • 招待講演
• [学会発表] 亜鉛サイクレン磁気ビーズを用いたチオール化合物の精製
  • 著者名/発表者名: 藤岡晴人，稗田雄三，常弘昌弥，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本市総合体育館，熊本市
• [備考] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能化学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [備考] 新学術領域 修飾シグナル病
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html
• [備考] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能科学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [備考] 新学術領域研究『修飾シグナル』
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html