転写産物の高精細プロファイリングによる転写と転写後プロセシングの共役機構の解明

• 研究領域: 高精細アプローチで迫る転写サイクル機構の統一的理解
• 研究課題/領域番号: 25118506
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 黒柳 秀人 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (30323702)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 11,700千円 (直接経費: 9,000千円、間接経費: 2,700千円); 2014年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円); 2013年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
• キーワード: 新生RNA / 線虫 / 細胞分画 / 核質 / クロマチン / 大規模シーケンス解析

研究実績の概要

計画Ａとして、当初は5-ブロモウリジン（BrU）による線虫新生RNAの標識を計画していたが、ビーズで精製後の溶出の容易さや特異性を考慮し、4-チオウリジン（4SU）による代謝標識とビオチン化した上での精製を試み、これまでに、哺乳類培養細胞を用いた代謝標識と精製のプロトコルを確立した。線虫を用いて4SUによるRNAの代謝標識と精製が可能であることも確認し、標識時間をより短くして新生RNAの継時的な変化を追跡するためのプロトコルを検討中である。また、同様の手法で4-チオウリジン三リン酸（4SUTP）によるNuclear Run-On法での新生RNAの標識も確認できた。線虫胚および幼虫由来初代分散細胞での標識は試みるに至らなかった。
平成25年度新学術領域研究「ゲノム支援」の支援を受けて、同調した線虫のL1幼虫の細胞質、核質、クロマチン画分の全RNAの大規模シーケンス解析し、得られた結果の生物情報学的分析を行った。その結果は、核質画分でもクロマチン画分でも、mRNAのほとんどがすでにプロセシングが完了しているという想定外のものであった。これは、新生RNAのプロセシングが極めて速やかに行われるか、プロセシングを受けたRNAが長時間核内にとどまっていることを示唆している。
上記の結果は、新生RNAの継時的動態、細胞内動態を解析するには、新生RNAの代謝標識を行ったうえでの経時変化の追跡や細胞分画が欠かせないことを示す。これを計画Ｃとしていたが、4SU標識法を検討したため予定より遅延している。本研究課題が平成27～28年度に継続になったことから、引き続き平成27年度にこの内容を計画している。
計画Ｄの変異型RNAポリメラーゼIIを持つ線虫の作製方法として、当初の計画にはないCRISPR/Cas9系による内在性ama-1遺伝子のゲノム編集による改変を試みたが、これまでのところ変異体は得られていない。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] RBFOX and SUP-12 sandwich a guanine base to form a stable complex and regulate tissue-specific splicing. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kuwasako K, Takahashi M, Unzai S, Tsuda K, Yoshikawa S, He F, Kobayashi N, Guntert P, Shirouzu M, Ito T, Tanaka A, Yokoyama S, Hagiwara M, Kuroyanagi H, and Muto Y.
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol. 巻: 21(9) 号: 9 ページ: 778-86
  • DOI: 10.1038/nsmb.2870
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive analysis of mutually exclusive alternative splicing in C. elegans. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kuroyanagi H, Takei S, Suzuki Y.
  • 雑誌名: Worm 巻: 3 号: 1 ページ: e28459-e28459
  • DOI: 10.4161/worm.28459
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive analysis of mutually exclusive alternative splicing in C. elegans (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidehito Kuroyanagi, Satomi Takei, Yutaka Suzuki
  • 雑誌名: Worm 巻: 3
  • 査読あり
• [学会発表] RBFOX and SUP-12 cooperatively regulate muscle-specific alternative splicing to determine ligand-binding specificity of FGF receptors in C. elegans (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidehito Kuroyanagi
  • 学会等名: 理研シンポジウム「Noncoding RNA Regulation」
  • 発表場所: 理化学研究所 和光キャンパス 鈴木梅太郎ホール
  • 年月日: 2014-10-01
  • 招待講演
• [学会発表] 選択的スプライシング制御因子ASD-1とSUP-12による協働的なRNA 認識の構造基盤 (2014)
  • 著者名/発表者名: 桑迫香奈子，高橋真梨，雲財悟，津田健吾，吉川征子，何発虎，小林直弘，Peter Güntert，白水美香子，伊藤拓宏，田仲昭子，横山茂之，萩原正敏，黒柳秀人，武藤裕.
  • 学会等名: 第16回日本RNA 学会年会
  • 発表場所: ウィンクあいち
  • 年月日: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [学会発表] Cooperative regulation of tissue-specific alternative splicing by multiple splicing factors determines ligand-binding specificity of FGF receptors. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidehito Kuroyanagi.
  • 学会等名: The 9th International Symposium of the Institute Network
  • 発表場所: 大阪大学
  • 年月日: 2014-06-19 – 2014-06-20
  • 招待講演
• [学会発表] mRNA前駆体の選択的プロセシングパターンを可視化して解析する (2013)
  • 著者名/発表者名: 黒柳秀人
  • 学会等名: 日本農芸化学会中部支部第169回例会若手シンポジウム
  • 発表場所: 岐阜大学 サテライトキャンパス
  • 招待講演
• [学会発表] 蛍光タンパク質レポーターを用いたmRNA前駆体の転写後プロセシング制御機構の遺伝学的解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 黒柳秀人
  • 学会等名: 日本遺伝学会第85回大会
  • 発表場所: 慶應義塾大学 日吉キャンパス
  • 招待講演
• [学会発表] Multi-domain protein LST-3 regulates pre-mRNA transcription and alternative splicing in C. elegans (2013)
  • 著者名/発表者名: Hidehito Kuroyanagi, Marina Togo, Yohei Watanabe, Motoki Hoshina, Yutaka Suzuki and Masatoshi Hagiwara
  • 学会等名: CSHL Meeting on Eukaryotic mRNA Processing
  • 発表場所: Cold Spring Harbor, NY, USA
• [備考] 東京医科歯科大学難治疾患研究所フロンティア研究室遺伝子発現制御学
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/end/
• [備考] 東京医科歯科大学難治疾患研究所
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/mri/press/
• [備考] 東京医科歯科大学 フロンティア研究室 遺伝子発現制御学
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/end/index.html