| 研究領域 | 細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎 |
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| 研究課題/領域番号 |
25121708
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上田 卓見 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20451859)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2014年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2014年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2013年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 膜蛋白質 / NMR / GPCR / 構造生物学 |
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| 研究実績の概要 |
muオピオイド受容体を昆虫細胞に発現させて、SDS-PAGEで90%以上の純度となるまで精製した。得られたmuオピオイド受容体が、NMR測定の間リガンド結合活性を保持していることを確認した。また、得られたmuオピオイド受容体を再構成高密度リポ蛋白質の脂質二重膜中に再構成した上で、アゴニスト存在下において、G蛋白質のGDP-GTP交換およびGRKによるSer377のリン酸化を促進することを確認した。
次に、部分重水素化およびメチオニン残基選択標識を施した、界面活性剤に可溶化したmuオピオイド受容体を調製した上で、アンタゴニストおよび完全アゴニスト添加して1H-13C HMQCスペクトルを取得した。その結果、概ねオピオイド受容体のメチオニン残基数に対応するシグナルが観測された。次に、各メチオニン残基の変異体のスペクトルを取得して、変異導入前のスペクトルと比較することにより、シグナルを帰属した。
次に、部分アゴニストを添加した状態における、1H-13C HMQCスペクトルを取得した。その結果、アンタゴニスト結合状態と化学シフトが同じシグナルと、完全アゴニスト結合状態と化学シフトが同じシグナルが両方観測された。各リガンド結合状態における両シグナルの強度比が、上記のアッセイにより決定したefficacyと良く対応していたことから、オピオイド受容体が細胞内のキャビティが閉じた不活性化状態とキャビティが開いた活性化状態の構造平衡にあることが示された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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