X線結晶構造解析・核磁気共鳴法の融合によるキナーゼ複合体の動的立体構造解析

• 研究領域: 細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
• 研究課題/領域番号: 25121743
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 独立行政法人産業技術総合研究所
• 研究代表者: 竹内 恒 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 主任研究員 (20581284)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 9,100千円 (直接経費: 7,000千円、間接経費: 2,100千円); 2014年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2013年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
• キーワード: 構造生物学 / キナーゼ / 複合体 / 立体構造解析 / X線結晶構造解析 / NMR

研究実績の概要

MAPK p38はドッキング配列を有するMK2などの基質をリン酸化することで、各種のストレス下における細胞応答を担う。これまでの研究でドッキング相互作用が基質リン酸化部位とは離れた位置で結合親和性を担うことは明らかであったが、ドッキング相互作用により活性中心での反応複合体の形成が自発的に誘起されるのか否かは明らかでなかった。そこで溶液NMR法を用いて、ドッキング配列とリン酸化部位を含むMK2由来のモデル基質とリン酸化された活性化状態のp38との結合を立体構造的に解析した。その結果、ATPなしの条件ではp38のドッキング部位のシグナルが顕著な化学シフト変化を示す一方、基質リン酸化部位周辺のシグナルはペプチド添加による影響を受けないことが判明した。このことはATPなしの条件ではドッキング相互作用は起こっているものの、基質リン酸化部位は活性中心に結合せず反応複合体が形成されていないことを示している。一方、ATP存在下で同様の実験を行うと、ドッキング部位のみならず基質リン酸化部位も化学シフト変化を示し、基質リン酸化部位は ATP 結合状態のp38の活性中心にのみ結合することが示された。よって、ドッキング相互作用は反応複合体の形成と等価ではなく、結合部位がより深い位置にあるATPの結合を優先させることで、反応複合体の形成効率を高めていると考えた。独自の研究で明らかにしていたドッキング相互作用によるATP親和性、反応速度のアロステリックな増大と考え合わせると、ドッキング配列を含む基質は広いATP濃度で優先的かつ安定的にリン酸化されることになる。ストレス条件下ではATP濃度が低下するなど生体分子の細胞内濃度大きく変化することが知られている。ドッキング配列によるアロステリックな活性増強は、ストレス刺激に伴いATP 濃度の低下する条件においても、p38シグナリングを維持する巧妙な機構である。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Allosteric enhancement of MAP kinase p38α's activity and substrate selectivity by docking interactions (2014)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga Y, Takeuchi K, Takahashi H, Shimada I
  • 雑誌名: Nat Struct Mol Biol 巻: 21 号: 8 ページ: 704-711
  • DOI: 10.1038/nsmb.2861
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Functional dynamics of cell surface membrane proteins (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Osawa M, Takeuchi K, Imai S, Stampoulis P, Kofuku Y, Ueda T, Shimada I
  • 雑誌名: J Magn Reson 巻: 241 ページ: 86-96
  • DOI: 10.1016/j.jmr.2013.11.007
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Degradation of activated K-Ras orthologue via K-Ras-specific lysine residues is required for cytokinesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sumita K, Yoshino H, Sasaki M, Majd N, Kahoud ER, Takahashi H, Takeuchi K, Kuroda T, Lee S, Charest PG, Takeda K, Asara JM, Firtel RA, Anastasiou D, Sasaki AT.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 289 号: 7 ページ: 3950-9
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.531178
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure-based approach to improve a small-molecule inhibitor by the use of a competitive peptide ligand. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ono K, Takeuchi K, Ueda H, Morita Y, Tanimura R, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: Angew Chem Int Ed Engl 巻: 53 号: 10 ページ: 2597-2597
  • DOI: 10.1002/anie.201310749
  • 査読あり
• [雑誌論文] Perdeuteration and methyl-selective (1)H, (13)C-labeling by using a Kluyveromyces lactis expression system (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyazawa-Onami M, Takeuchi K, Takano T, Sugiki T, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: J Biomol NMR 巻: 57 号: 3 ページ: 297-304
  • DOI: 10.1007/s10858-013-9789-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rapid identification of ligand-binding sites by using an assignment-free NMR approach (2013)
  • 著者名/発表者名: Kodama Y, Takeuchi K, Shimba N, Ishikawa K, Suzuki E, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: J Med Chem 巻: 56 号: 22 ページ: 9342-9350
  • DOI: 10.1021/jm4014357
  • 査読あり
• [学会発表] 徳永 裕二,竹内 恒,高橋 栄夫,嶋田 一夫 (2014)
  • 著者名/発表者名: MAPキナーゼ p38αのストレスシグナル伝達機構の解明
  • 学会等名: 第53回NMR討論会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター（大阪府吹田市）
  • 年月日: 2014-11-04 – 2014-11-08
• [学会発表] 多剤耐性転写制御因子の運動性と薬剤認識機構のNMR解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 竹内 恒、高橋 栄夫、嶋田 一夫
  • 学会等名: 日本核磁気共鳴学会
  • 発表場所: 石川県立音楽堂（金沢市）
• [図書] 「揺らぎ・ダイナミクスと生体機能」第19章・第5項~第9項 (2013)
  • 著者名/発表者名: 竹内恒、徳永裕二、嶋田一夫
  • 総ページ数: 350
  • 出版者: 同人バイオサイエンス