PBAT法による高感度なエクソメチロームとエクソヒドロキシメチローム解析の実現

• 研究領域: パーソナルゲノム情報に基づく脳疾患メカニズムの解明
• 研究課題/領域番号: 25129702
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 九州大学 (2014); 東京大学 (2013)
• 研究代表者: 三浦 史仁 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50447348)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2014年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円); 2013年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
• キーワード: DNAメチル化 / ターゲット解析 / PBAT法 / バイサルファイトシークエンシング / 次世代シークエンサー / メチローム / 5-メチルシトシン / 5-ヒドロキシメチルシトシン / ハイブリダイゼーションキャプチャー / エピゲノム / エピジェネティクス

研究実績の概要

ターゲットメチロームシークエンシング（TMS）解析は、液相ハイブリダイゼーション（LH）法により特定のゲノム領域を濃縮し、得られたDNA断片をショットガンバイサルファイトシークエンシングに供してDNAメチル化状態を決定する手法である。この方法は、ゲノムサイズが比較的大きい生物において、配列決定のためのコストを抑制しながら高精度なメチロームデータを収集ことが可能であるが、これまでに報告されているTMSの鋳型調製法は大量の開始DNAが必要で実用性に欠けていた。そこで、本研究ではこれまで研究代表者らが開発してきたPost-bisulfite adaptor tagging（PBAT）法をTMSの鋳型調製に応用することで、TMSの高感度化を試みた。まず、標準的なPBAT法のプロトコールをLHにより回収されたDNAに適用したが、この系は再現性に乏しく改善の余地があった。そこで、PBAT法におけるランダムプライミング反応の高効率化と実験の再現性向上に取り組んだ。その結果、従来のPBAT法で用いていた3′末端に4塩基の完全縮重塩基が付加されたプライマーに比べて、数塩基のATのみの縮重塩基が追加されたプライマーを用いると、TMSの鋳型収量と実験の再現性が高まることが判明した。また、LHの条件検討を行い、ホルムアミド添加による十分な変性が実験の再現性向上に効果があることを見いだした。これらの検討結果を総合してSureSelect-PBAT法を確立し、論文をDNA Research紙に投稿した。さらには、アジレント社と協力しSureSelect-PBAT法のプロトコールの詳細をアプリケーションノートとしてまとめ公開した。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Highly sensitive targeted methylome sequencing by post-bisulfite adaptor tagging (2015)
  • 著者名/発表者名: Fumihito Miura and Takashi Ito
  • 雑誌名: DNA Research 巻: 22 号: 1 ページ: 13-18
  • DOI: 10.1093/dnares/dsu034
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] High-resolution DNA methylome analysis of primordial germ cells identifies gender-specific reprogramming in mice (2013)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, H., Sakurai, T., Miura, F., Imai, M., Mochizuki, K., Yanagisawa, E., Sakashita, A., Wakai, T., Suzuki, Y., Ito, T., Matsui ,Y., Kono, T
  • 雑誌名: Genome Research 巻: 23 号: 4 ページ: 616-627
  • DOI: 10.1101/gr.148023.112
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mouse oocyte methylomes at base resolution reveal genome- wide accumulation of non-CpG methylation and role of DNA methyltransferases (2013)
  • 著者名/発表者名: Shirane K, Toh H, Kobayashi H, Miura F, Chiba H, Ito T, Kono T, Sasaki H
  • 雑誌名: PLoS Genet 巻: 9(4) 号: 4 ページ: 303-306
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003439
  • 査読あり
• [学会発表] PBATによるショットガンバイサルファイトシークエンシングの高感度化とその応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 三浦史仁、伊藤隆司
  • 学会等名: 第３７回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神奈川県横浜市
  • 年月日: 2014-11-27
• [学会発表] 高感度なターゲットヒドロキシメチローム解析の実現に向けて (2014)
  • 著者名/発表者名: 三浦史仁、伊藤隆司
  • 学会等名: 第８回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 東京都文京区
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-27
• [学会発表] PBATによる高感度なターゲットメチロームシークエンス (2013)
  • 著者名/発表者名: 三浦史仁、伊藤隆司
  • 学会等名: 第7回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 奈良県 奈良市公会堂
• [学会発表] Highly sensitive target methylome sequencing by post-bisulfite adaptor tagging (2013)
  • 著者名/発表者名: Fumihito Miura and Takashi Ito
  • 学会等名: The 10th International Workshop on Advanced Genomics
  • 発表場所: Hitotsubashi Memorial Hall, Tokyo
• [学会発表] 高効率な酸化的バイサルファイトシークエンシング (2013)
  • 著者名/発表者名: 三浦史仁、伊藤隆司
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸市 神戸コンベンションセンター
• [学会発表] ホヤのメチローム解析から探る組織特異的メチル化の起源 (2013)
  • 著者名/発表者名: 横山貴央、三浦史仁、岡村浩司、日下部岳広、伊藤隆司
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸市 神戸コンベンションセンター
• [学会発表] 2ステップで行うDNAの5’末端固相化方法 (2013)
  • 著者名/発表者名: 仲田啓子、三浦史仁、伊藤隆司
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸市 神戸コンベンションセンター
• [備考] Simple Genome Browser
  • URL: http://itolab.med.kyushu-u.ac.jp/cgi-bin/DesktopTracks/agilent/Browser
• [備考] Simple Genome Browser
  • URL: http://itolab.med.kyushu-u.ac.jp/cgi-bin/DesktopTracks/agilent2/Browser