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エキソーム解析における難読領域を標的とする解読法の開発

公募研究

研究領域パーソナルゲノム情報に基づく脳疾患メカニズムの解明
研究課題/領域番号 25129706
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関慶應義塾大学

研究代表者

工藤 純  慶應義塾大学, 医学部, 教授 (80178003)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2015-03-31
研究課題ステータス 完了 (2014年度)
配分額 *注記
10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2014年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
2013年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
キーワードエキソーム / ゲノム / 次世代シーケンサー / バイオテクノロジー / 遺伝子
研究実績の概要

本研究ではエキソーム解析における難読領域を対象として、その解読技術の開発を目指した。SureSelectを用いて得られたエキソーム解析の724kbからなる難読領域の多くはGC含量が高い(67.8%)配列であった。この難読領域を解読するためにHaloPlexターゲットエンリッチメントシステムによる難読領域の増幅と解読を試みた。約724kb/19,715カ所全体を標的としたところ約709kb(97.96%)の標的領域を計63,886個のAmplicon(シーケンス長計4.7Mb)として増幅するHaloPlexプローブライブラリーが作成できた。このライブラリーを用いて全ゲノムDNAから標的領域のDNAを増幅し、回収したDNA断片を次世代シーケンサーで平均カバレッジ256倍で解読したところ、709kbの標的領域のうち約83%について10倍以上の厚みで解読に成功した。これにより、エキソーム解析の大部分を解読することが可能になった。HaloPlex法でも解読できなかったGC含量が高い(78.4%)難読領域は、125kb/3500個所であった。難読領域長は長いものから100番目で178bp(合計24.2kb)、500番目で80bp(合計70.9kb)、1000番目で40bp(合計100kb)、1500番目で22bp(合計115.2kb)となり、当然のことながら、解析数を増やしても、その割には解読できる領域が長くなる訳ではなかった。長いものから順に、96組のPCRプライマーの設計を試みたところ、設計の成功率78%(96/123箇所)で、領域サイズは、421~167bp(合計21,518bp)となった。GC含量は、65/96で80%以上、89/96が70%以上と高かった。これら96組のプライマーを用いたPCRの結果、83/96(86%)で増幅が認められ、解読も可能であるものと思われる。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2014 実績報告書
  • 2013 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Mutations in SERPINB7, Encoding a Member of the Serine Protease Inhibitor Superfamily, Cause Nagashima-type Palmoplantar Keratosis2013

    • 著者名/発表者名
      Kubo A, Shiohama A, Sasaki T, Nakabayashi K, Kawasaki H, Atsugi T, Sato S, Shimizu A, Mikami S, Tanizaki H, Uchiyama M, Maeda T, Ito T, Sakabe J, Heike T, Okuyama T, Kosaki R, Kosaki K, Kudoh J, Hata K, Umezawa A, Tokura Y, Ishiko A, Niizeki H, Kabashima K, Mitsuhashi Y, Amagai M
    • 雑誌名

      Am J Hum Genet

      巻: 93 号: 5 ページ: 945-956

    • DOI

      10.1016/j.ajhg.2013.09.015

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Mutations in SERPINB7, encoding a serine protease inhibitor, cause Nagashima-type palmoplantar keratosis2014

    • 著者名/発表者名
      Kubo, A. Shiohama, T. Sasaki, K. Nakabayashi, J. Kudoh, K. Hata, A. Umezawa, Y. Tokura, A. Ishiko, H. Niizeki, K. Kabashima, Y. Mitsuhashi, M. Amagai
    • 学会等名
      2014 Society for Investigative Dermatology Annual Meeting
    • 発表場所
      Albuquerque, New Mexico, USA
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] 長島型掌蹠角化症の原因遺伝子SERPINB7の同定と患者30例の変異解析2014

    • 著者名/発表者名
      久保 亮治、塩濱 愛子、佐々木 貴史、中林 一彦、奥山 虎之、小崎 健次郎、工藤 純、秦 健一郎、梅澤 明弘、戸倉 新樹、石河 晃、新関 寛徳、椛島 健治、三橋 善比古、天谷 雅行
    • 学会等名
      第113回日本皮膚科学会総会
    • 発表場所
      国立京都国際会館
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書

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公開日: 2013-05-15   更新日: 2019-07-29  

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