公募研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞由来sHspを用いて研究を進めた。CHO細胞由来Hsp27(HspB1)の配列において他のHsp27においてリン酸化が確認されているS15をアスパラギン酸に置換したリン酸化模倣体S15Dを構築した。S15DはWild Typeと比較して低温で、クエン酸合成酵素の凝集を抑制し、オリゴマーの解離が確認された。この結果から、動物細胞ではリン酸化のよりsHspのシャペロンとしての機能が活性化されることが明らかになった。また、解離する温度条件でのHPLCにおいてsHspのピークが消失するという問題があったが、エチレングリコールをバッファーに加えることによりピークが確認された。この結果は、Hsp27はオリゴマーが解離することにより疎水表面が露出し、カラムの担体と疎水相互作用することでピークが消失したことを示している。また、Hsp27の結晶化も試みたが、構造解析可能な結晶を得ることはできていない。in vivoでのリン酸化部位の特定を試みたが、これも成功していない。一方、これまでに報告されたsHspの多くは、非ストレス条件下でC末端領域のI-X-Iモチーフによりダイマー同士が結合し、高次オリゴマーを形成している。哺乳類に存在する10種類のsHsp（HspB1－HspB10）の内、HspB8とHspB9はI-X-Iモチーフを持たないことから、高次オリゴマーを形成せず一般的なsHspとは異なるシステムで機能していると考えられている。そこでCHO細胞由来HspB8とHspB9を大腸菌で発現・精製し、その機能・構造解析を行った。ゲル濾過HPLCを用いてHspB8及びHspB9の分子量を測定した。その結果、どちらも高次オリゴマーは形成せず、ダイマーで存在していることが確認できた。さらに、蛋白質凝集抑制活性において、基質特異性があることを示す結果が得られた。
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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すべて 雑誌論文 (7件) (うち国際共著 1件、 査読あり 7件、 謝辞記載あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (18件) (うち国際学会 3件)
J Mol Biol.
巻: 印刷中 号: 11 ページ: 2405-2417
10.1016/j.jmb.2016.04.006
eLS. John Wiley & Sons Ltd, Chichester.
巻: 該当なし ページ: 1-7
10.1002/9780470015902.a0026332
Proteins.
巻: 83 号: 12 ページ: 2230-2239
10.1002/prot.24938
FEBS Open Bio
巻: 5 号: 1 ページ: 124-131
10.1016/j.fob.2015.01.005
Angew. Chem., Int. Ed.
巻: 54 号: 37 ページ: 10763-10767
10.1002/anie.201502731
Biotechnol Bioeng
巻: 112 号: 1 ページ: 13-20
10.1002/bit.25322
The Journal of Biochemistry
巻: 157 号: 3 ページ: 161-168
10.1093/jb/mvu061
