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柔らかなタンパク質反応場を利用した立体選択的金属酵素の論理的開発

公募研究

研究領域理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
研究課題/領域番号 26104523
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関大阪大学

研究代表者

大洞 光司  大阪大学, 工学研究科, 助教 (10631202)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
研究課題ステータス 完了 (2015年度)
配分額 *注記
7,020千円 (直接経費: 5,400千円、間接経費: 1,620千円)
2015年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2014年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
キーワード酵素 / 蛋白質 / 分子動力学計算 / ヘム / 立体選択性
研究実績の概要

本年度は当該研究の最終年度であるので、前年度に作成した人工金属酵素の触媒活性の評価において得られた結果をフィードバックし、より高機能な人工金属酵素を設計し、実際にその調製および評価を実施した。反応場にはヘムタンパク質であるミオグロビンを用いて、ヘムタンパク質補因子置換法(再構成法)に基づき、ヘムを除去したアポタンパク質に人工補因子であるマンガンポルフィセンを挿入したものを基盤にして進めた。特にタンパク質側の変異による高機能化を狙い、分子動力学計算を利用した変異体設計と遺伝子工学的手法による変異導入を実施した。効率的なサンプルの調製を意識して、ストレップタグII付きのミオグロビン変異体を発現し、ストレプトタクチンカラムにより精製した。ヘムのマンガンポスフィセンの置換により得られた人工金属酵素については吸収スペクトルや質量分析を行い、同定した。過酸化水素駆動によるエチルベンゼンを基質とした水酸化触媒活性(触媒回転数)をガスクロマトグラフィー法(GC)により定量し、キラルカラムを用いて生成物の立体選択性を評価した。変異を導入する前は14%であった立体選択性が大幅に向上し、分子動力学計算を用いた設計の有用性が明らかになった。興味深いことに、実施した20のサンプルに対して計算と実験結果の相関を確かめるため、横軸に予測値、縦軸に実験値をプロットしたところ、良い相関が観測され、本手法による人工金属酵素の論理的な設計の可能性が確認された。さらに本設計手法は立体選択性だけでなく、触媒活性や位置選択性の向上にも応用できると期待される。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2015 実績報告書
  • 2014 実績報告書
  • 研究成果

    (19件)

すべて 2016 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Intraprotein transmethylation via a CH3–Co(III) species in myoglobin reconstituted with a cobalt corrinoid complex2016

    • 著者名/発表者名
      Y. Morita, K. Oohora, A. Sawada, K. Doitomi, J. Ohbayashi, T. Kamachi, K. Yoshizawa, Y. Hisaeda, T. Hayashi
    • 雑誌名

      Dalton Transactions

      巻: 45 号: 8 ページ: 3277-3284

    • DOI

      10.1039/c5dt04109k

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Crystal Structures and Coordination Behavior of Aqua- and Cyano-Co(III) Tetradehydrocorrins in the Heme Pocket of Myoglobin2016

    • 著者名/発表者名
      Y. Morita, K. Oohora, E. Mizohata, A. Sawada, T. Kamachi, K. Yoshizawa, T. Inoue, T. Hayashi
    • 雑誌名

      Inorganic Chemistry

      巻: 55 号: 3 ページ: 1287-1295

    • DOI

      10.1021/acs.inorgchem.5b02598

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Oxygen-binding Protein Fiber and Microgel: Supramolecular Myoglobin–Poly(acrylate) Conjugates2016

    • 著者名/発表者名
      T. Ono, Y. Hisaoka, A. Onoda, K. Oohora, T. Hayashi
    • 雑誌名

      Chem. Asian J.

      巻: 41 号: 7 ページ: 1036-1042

    • DOI

      10.1002/asia.201501415

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Energy migration within hexameric hemoprotein reconstituted with Zn porphyrinoid molecules2015

    • 著者名/発表者名
      Takashi Hayashi
    • 雑誌名

      Chemical Communications

      巻: 51 号: 55 ページ: 11138-11140

    • DOI

      10.1039/c5cc02680f

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Meso-dibenzoporphycene has a Large Bathochromic Shift and a Porphycene Framework with an Anomalous Cis Tautomeric Form2015

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora, Ayumu Ogawa, Tamaki Fukuda, Akira Onoda, Jun-ya Hasegawa, Takashi Hayashi
    • 雑誌名

      Angew. Chem., Int. Ed.

      巻: 印刷中 号: 21 ページ: 6227-6230

    • DOI

      10.1002/anie.201501496

    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Co(II)/Co(I) Reduction-induced Axial Histidine-flipping in Myoglobin Reconstituted with a Cobalt Tetradehydrocorrin as a Methionine Synthase Model2014

    • 著者名/発表者名
      Takashi Hayashi, Yoshitsugu Morita, Eiichi Mizohata, Koji Oohora, Jun Ohbayashi, Tsuyoshi Inoue, and Yoshio Hisaeda
    • 雑誌名

      Chem. Commun.

      巻: 50 号: 83 ページ: 12560-12563

    • DOI

      10.1039/c4cc05448b

    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Hemoprotein-based Supramolecular Assembling Systems2014

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora, Takashi Hayashi
    • 雑誌名

      Curr. Opin. Chem. Biol.

      巻: 19 ページ: 154-161

    • DOI

      10.1016/j.cbpa.2014.02.014

    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Dibenzoporphycene with Annulated Benzene Rings at Two Ethylene Bridges of the Porphycene Framework2016

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora,
    • 学会等名
      ICPP9
    • 発表場所
      南京、中国
    • 年月日
      2016-07-03
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] H2O2-dependent hydroxylation of C-H bond by myoglobin reconstituted with a manganese porphycene complex2015

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora
    • 学会等名
      Pacifichem2015
    • 発表場所
      ホノルル、ハワイ
    • 年月日
      2015-12-15
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 立体選択的な水酸化酵素をめざしたマンガンポルフィセン錯体を含むミオグロビンの設計と構築2015

    • 著者名/発表者名
      大洞 光司
    • 学会等名
      第53回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      金沢大学(石川県金沢市)
    • 年月日
      2015-09-13
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
  • [学会発表] ヘムタンパク質を基盤とした超分子集合体および人工酵素の調製2015

    • 著者名/発表者名
      大洞 光司
    • 学会等名
      第28回生物無機化学夏季セミナー
    • 発表場所
      山喜旅館(静岡県伊東市)
    • 年月日
      2015-08-28
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Catalytic Hydroxylation of C-H Bond by Mn Porphycene-containing Myoglobin2015

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora, Takako Nishiura, Hiroyuki Meichin, Takashi Hayashi
    • 学会等名
      Metals in Biology
    • 発表場所
      理化学研究所(埼玉県和光市)
    • 年月日
      2015-06-16
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 亜鉛置換型ヘムタンパク質環状六量体の光化学的性質2015

    • 著者名/発表者名
      大洞 光司、真島 剛史、平山 翔太、林 高史
    • 学会等名
      第13回 ホスト・ゲスト化学シンポジウム
    • 発表場所
      東北大学(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2015-06-06
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
  • [学会発表] Artificial light harvesting system constructed by reconstitution of a hexameric hemoprotein with Zn porphyrinoids2015

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora, Tsuyoshi Mashima, Takashi Hayashi
    • 学会等名
      5th Georgian Bay International Conference on Bioinorganic Chemistry
    • 発表場所
      オンタリオ、カナダ
    • 年月日
      2015-05-20
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] ポルフィセンマンガン錯体を挿入したミオグロビンの触媒的水酸化反応における活性中心近傍の変異と立体選択性2015

    • 著者名/発表者名
      西浦貴子・大洞光司・林高史
    • 学会等名
      日本化学会第95春季年会
    • 発表場所
      日本大学船橋キャンパス(千葉県船橋市)
    • 年月日
      2015-03-26
    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
  • [学会発表] C-H Bond Hydroxylation Catalyzed by Manganese Porphycene in a Myoglobin Matrix2014

    • 著者名/発表者名
      Koji Oohora, Takashi Hayashi
    • 学会等名
      錯体化学会第64会討論会
    • 発表場所
      中央大学後楽園キャンパス(東京都文京区)
    • 年月日
      2014-09-18
    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ミオグロビン変異体に挿入したポルフィセンマンガン錯体が触媒する水酸化反応の立体選択性2014

    • 著者名/発表者名
      西浦貴子、大洞光司、林高史
    • 学会等名
      第8回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      岡山大学津島キャンパス(岡山県岡山市)
    • 年月日
      2014-09-11
    • 関連する報告書
      2014 実績報告書
  • [備考] 大阪大学大学院工学研究科林研究室

    • URL

      http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~hayashiken/index.html

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
  • [備考] 大阪大学 林研究室

    • URL

      http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~hayashiken/index.html

    • 関連する報告書
      2014 実績報告書

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公開日: 2014-04-04   更新日: 2018-03-28  

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