哺乳類細胞での合成生物学を志向した次々世代型ジェネティックエンジニアリング技術

• 研究領域: 動的・多要素な生体分子ネットワークを理解するための合成生物学の基盤構築
• 研究課題/領域番号: 26119703
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 野村 渉 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80463909)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 13,260千円 (直接経費: 10,200千円、間接経費: 3,060千円); 2015年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円); 2014年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
• キーワード: タンパク質 / DNA / ゲノム編集 / CRISPR-Cas / テロメア / hTERT / CRISPR/Cas

研究実績の概要

本研究では哺乳類細胞のゲノムに特化した技術、任意の標的配列を編集もしくは改変できる技術としてヌクレアーゼによるゲノム編集技術であるZFN、TALEN、CRISPR-Cas9システムの3技術の各特長を組み合わせ、合成生物学研究に利用できる基盤技術としての体系化を推進した。その成果として、ラパマイシンにより会合が誘導されるFKBP-FRBドメインを利用したDNA切断系の構築と転写制御システムへの応用が挙げられる。ZF、TALEドメインにFKBPを融合し、FokIドメインにFRBを融合させたタンパク質を構築した。ZFN、TALENでは標的配列上でFokIドメインが二量体形成してDNA切断が誘導される。DNA結合ドメインとFokIドメインをつなぐリンカー部分にFKBP、FRBを導入し、ラパマイシン添加によって二量体形成が再現される仕組みとした。各ドメインをin vitro translationで得て、in vitroでの標的DNA切断実験を行った。その結果、ZFNとTALE-FKBP/FRB-FokIの組み合わせで切断が確認された。リンカー部分にFKBP-FRB会合ドメインを利用しているため、標的配列の最適化によってより高い切断効率が得られると予測されるため今後の課題としている。ラパマイシンによる転写活性制御においてはTALEドメイン／dCas9を基にIL-1RNプロモーター領域に結合するDNA結合タンパク質を作製し、ラパマイシン存在下において、転写活性化または抑制ドメインと会合して転写活性制御ができる仕組みを構築した。哺乳類細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイによってラパマイシン添加の有無によって遺伝子発現調節のon/offが可能であり、プロモーター領域の複数箇所を標的とすることで各人工転写因子の協奏的な効果が得られた。また、内因性遺伝子プロモーターにも適用可能であった。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] 人工酵素によるゲノム編集工学とその応用，可能性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 雑誌名: 薬学雑誌 巻: 135 号: 3 ページ: 405-414
  • DOI: 10.1248/yakushi.14-00240-5
  • NAID: 130004756508
  • ISSN: 0031-6903, 1347-5231
  • 年月日: 2015-03-01
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ターゲットタンパク質を特異的に認識するプローブ (2014)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉、玉村 啓和
  • 雑誌名: 化学工業 巻: 65 ページ: 8-14
• [雑誌論文] Screening for Protein Kinase C Ligands Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohashi N, Nomura W, Minato N, Tamamura H.
  • 雑誌名: ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＆ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＢＵＬＬＥＴＩＮ 巻: 62 号: 10 ページ: 1019-1025
  • DOI: 10.1248/cpb.c14-00419
  • NAID: 130004677396
  • ISSN: 0009-2363, 1347-5223
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of a fluoride-responsive amide bond cleavage device that is potentially applicable to a traceable linker (2014)
  • 著者名/発表者名: J. Yamamoto, N. Maeda, C. Komiya, T. Tanaka, M. Denda, K. Ebisuno, W. Nomura, H. Tamamura, Y. Sato, A. Yamauchi, A. Shigenaga, and A. Otaka
  • 雑誌名: Tetrahedron 巻: 70 号: 34 ページ: 5122-5127
  • DOI: 10.1016/j.tet.2014.05.110
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Development of the 8-aza-3-bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl group as a new entry of photolabile protecting groups (2014)
  • 著者名/発表者名: Takano, H., Narumi, T., Ohashi, N., Suzuki, A., Furuta, T., Nomura, W., Tamamura, H.
  • 雑誌名: Tetrahedron 巻: XX 号: 29 ページ: 4400-4404
  • DOI: 10.1016/j.tet.2014.04.063
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a traceable linker containing a thiol-responsive amino acid for the enrichment and selective labelling of target proteins (2014)
  • 著者名/発表者名: J. Yamamoto, M. Denda, N. Maeda, M. Kita, C. Komiya, T. Tanaka, W. Nomura, H. Tamamura, Y. Sato, A. Yamauchi, A. Shigenaga, and A. Otaka
  • 雑誌名: Org. Biomol. Chem. 巻: 12 号: 23 ページ: 3821-3826
  • DOI: 10.1039/c4ob00622d
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] Efficient conversion of genomic promoter region by genome engineering systems (2015)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: Pacifichem 2015
  • 発表場所: ホノルル（アメリカ合衆国）
  • 年月日: 2015-12-15
  • 国際学会
• [学会発表] Simultaneous digestion by site-specific nucleases for efficient gene deletion: Study of hTERT promoter function (2015)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: Conference on Transposition and Genome Engineering 2015
  • 発表場所: 奈良春日野国際フォーラム（奈良県・奈良市）
  • 年月日: 2015-11-17
  • 国際学会
• [学会発表] Genome Deletion by ZFN and CRISPR-Cas Targeting Promoter Region for Analysis of hTERT Function (2015)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: 細胞を創る 研究会8.0
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス銀杏会館（大阪府・吹田市）
  • 年月日: 2015-11-12
• [学会発表] 人工転写因子の協奏的な働きによる遺伝子発現調節機構の構築 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉井太亮、野村 渉、玉村啓和
  • 学会等名: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • 発表場所: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • 年月日: 2015-09-12
• [学会発表] 配列特異的分割型DNAメチル化酵素の作用機構解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉、大浦伊代、玉村啓和
  • 学会等名: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • 発表場所: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • 年月日: 2015-09-12
• [学会発表] ペプチド性機能分子のデザインと応用 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 学会等名: 第47回若手ペプチド夏の勉強会
  • 発表場所: アスティかたおか（長野県・塩尻市）
  • 年月日: 2015-08-11
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝子を標的とした創薬ケミカルバイオロジー研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 学会等名: 長浜バイオ大学大学院講義
  • 発表場所: 長浜バイオ大学（滋賀県・長浜市）
  • 年月日: 2015-08-10
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集技術を用いた複数箇所切断によるプロモーター領域の配列変換 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉、増田朱美、玉村啓和
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第10回年会
  • 発表場所: 東北大学川内キャンパス萩ホール（宮城県・仙台市）
  • 年月日: 2015-06-10
• [学会発表] 人工DNA修飾酵素の構築戦略とゲノム・エピゲノム編集への展開 (2015)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸学院大学
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-28
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集法による効率的な配列欠損反応 (2014)
  • 著者名/発表者名: 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • 学会等名: 細胞を創る会7.0
  • 発表場所: 東京大学弥生講堂
  • 年月日: 2014-11-13 – 2014-11-14
• [学会発表] プロモーター領域を標的としたDNA二重鎖切断による配列欠損反応の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • 学会等名: 第4回ゲノム編集研究会
  • 発表場所: 広島国際会議場
  • 年月日: 2014-10-06 – 2014-10-07
• [学会発表] ゲノム編集法による複数箇所同時切断が示す配列欠損反応効率の向上 (2014)
  • 著者名/発表者名: 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • 学会等名: 第8回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 岡山大学津島キャンパス
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [学会発表] Efficient Gene Disruption at hTERT Promoter Region by Simultaneous Digestion by Pairs of ZFNs or Guide RNAs of CRISPR/Cas System (2014)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: The 28th Annual Symposium of Protein Society
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 2014-07-27 – 2014-07-30
  • 招待講演
• [学会発表] Enhanced Gene Disruption at Specific Promoter Region By Simultaneous Digestion of ZFN or CRISPR/Cas System (2014)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: The Synthetic Biology: Engineering, Evolution & Design (SEED) conference 2014
  • 発表場所: Manhattan Beach, USA
  • 年月日: 2014-07-14 – 2014-07-17
• [学会発表] Enhanced Gene Disruption by Simultaneous Digestion of ZFN or CRISPR/Cas System at hTERT Promoter Region (2014)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • 学会等名: FASEB SRC "Genome Engineering Cutting-Edge Research and Applications
  • 発表場所: Nassau, Bahamas
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-27
• [図書] pp19-20, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • 著者名/発表者名: Takano H, Narumi T, Ohashi N, Nomura W, Furuta T, Tamamura H.
  • 総ページ数: 369
  • 出版者: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [図書] pp75-76, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • 著者名/発表者名: Nomura W, Koseki T, Mizuguchi T, Tamamura H.
  • 総ページ数: 369
  • 出版者: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [図書] pp103-104, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • 著者名/発表者名: Honda Y, Mizuguchi T, Nomura W, Tamamura H.
  • 総ページ数: 369
  • 出版者: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [備考] 東京医科歯科大学 玉村研究室 ホームページ
  • URL: http://tamamura-tmd.sakura.ne.jp/