計画研究
生体内での生合成や代謝反応の多くは、酵素が介在し、基質選択性と生成物の立体制御を伴いながら温和な条件下で速やかに進行している。酵素が優れた触媒である主な要因は、長い年月の進化を経て最適化された活性中心とその周辺近傍の精密な分子構造が形成する反応場を有することにある。したがって、我々が新しい触媒を構築する際には、酵素の精巧な反応場を学ぶことが、きわめて有意義である。本研究では、タンパク質の空孔に非天然金属錯体を挿入した新しい反応場を構築し、天然の金属錯体の活性を凌駕する人工生体触媒の構築や、天然では見られない有機反応を触媒する新しい金属酵素の開発が目的である。当該年度は、有用な空孔を有するタンパク質として、ヘムタンパク質のアポ体（ヘムを除去したタンパク質）に焦点をあてた。ヘムタンパク質は補欠分子であるヘム（ポルフィリン鉄錯体）とタンパク質が結合して機能を発揮する生体分子である。このヘムの多くはプロトヘムIX (heme b)であり、配位結合を含む非共有結合でタンパク質と安定な複合体を形成している。したがって、ヘムタンパク質を酸処理することにより、ヘムを除去したアポ体を入手することが可能である。得られたアポ体が安定であれば、ヘムポケットにはユニークな空孔が存在し、そこに適した金属錯体を導入することが可能である。具体的には、本来NOを結合するnitrobindin (NB)と呼ばれるヘムタンパク質に着目し、天然のヘムを除去したアポ体の空孔にRhCp錯体を導入し、フェニルアセチレンの重合反応を試みた。実際には、NBの空孔の内部構造・環境を遺伝子工学的に改変したタンパク質にRhCp錯体を導入し、人工的に得られた生体金属触媒を水中で使うことによって、本来はシス体が得られるアセチレンのポリマーについてトランス体が優先して得られることを見出した。
2: おおむね順調に進展している
通常、phenylacetyleneは、Rh触媒を用いることによりcis体のポリマーが得られる。我々は、マレイミド基を側鎖に導入したCp配位子を有するRh錯体を、NBの96番目をCysに置換したNB(Q96C)変異体と反応させることで、Rh錯体をβバレル空孔内に装着したハイブリッド生体触媒を作製した。本来Rh錯体を触媒として用いた際のポリマーのtrans/cisの比が7:93 となる重合反応において、ハイブリッド触媒を用いると、trans/cisの比は54:46に変化した。これは、Rh触媒を含むタンパク質の反応場によって、アセチレンの活性種への接近方向が規制されたことが一因と考えられる。この知見をもとに、さらに反応場を形成するβバレル空孔周辺の幾つかのアミノ酸を順次別のアミノ酸に置換することを試み、合計10種類以上のNB変異体を調製し、それぞれRh錯体を導入して、ポリマーの立体選択性を評価した。その結果、NB(F44W/H76L/Q96C/H158L)及びNB(H76L/Q96C/H158L)において、trans/cisの比は、それぞれ77:23、82:18となり、transポリマーが優先して生成する触媒を獲得した。本結果は、Rh触媒周囲の第２配位圏として振る舞うタンパク質マトリクス（βバレル）の構造や環境を改変することにより、生成物の立体を制御することが可能であることを示している。次に、NBに対して、マレイミド基を側鎖に有するterpyridineを空孔に修飾し、銅2価イオンを添加することで、銅錯体を有するNBを調製した。このハイブリッド触媒を用い、azachalconeとcyclopentadieneをそれぞれdienophileとdieneとするDiels-Alder反応を試みた。その結果、単純なCu-terpyridine錯体に比べ、反応の転化率は約２倍、endo選択性も90%まで向上した。本系に関しては、まだまだ触媒回転数等に改善の余地があるが、タンパク質マトリクスを用いることで、従来の触媒を超える反応性や立体選択性を得ることが示された。
これまでの研究で、NO結合ヘムタンパク質であるnitrobindin (ND)は、構造が非常に安定であり、ヘムを除去した後のアポ体も、ヘムを除去する前のホロ体とほとんどβバレル構造に変化が無いことが知られている。したがって、βバレル内側のアミノ酸変異によって、挿入した金属錯体周囲の環境も、作成する前に計算によって予測可能である。そこで、我々はタンパク質の動力学的計算を実施するソフトウエア(YASARA)を駆使して、錯体周囲の第２配位圏の構造を予測し、錯体にどんな方向で基質が接近し、どのような立体の生成物を選択的に誘導するかについて、それなりの情報を得られるようになっている。したがって、我々は事前に、人工金属タンパク質の活性中心およびその周辺の構造の最適化を図り、今後はさらなる安定かつ高活性の酵素類似触媒の開発を推し進める予定である。反応については、C-H結合の活性化やC-C結合形成、あるいは水素発生やCO2固定など、難易度の高い物質変換に焦点をあて、天然では見られない反応を選択的に行う人工金属酵素の開発を推し進める。
すべて 2016 2015 その他
すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 2件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 4件、 招待講演 4件)
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