| 研究領域 | 反応集積化が導く中分子戦略：高次生物機能分子の創製 |
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| 研究課題/領域番号 |
15H05838
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
永次 史 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (90208025)
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| 研究分担者 |
鬼塚 和光 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (00707961)
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| 研究期間 (年度) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 機能性中分子 / RNA高次構造 / RNA結合分子 / アルキル化反応 / G-カルテット構造 / 反応性プローブ |
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| 研究実績の概要 |
近年、核酸は配列情報のみならず、形成される高次構造が遺伝子発現において重要な機能を持つことが明らかとなってきている。特に種々の機能性RNAではその機能を担うモチーフとして、様々なRNAの高次構造が重要であることがわかってきている。しかし現在これらの構造に結合するプローブはほとんど報告されておらず、その機能解明が進んでいない。これらの高次構造に結合しアルキル化反応を誘起するプローブはこれらの構造の役割を明らかにするのみならず、共有結合による強固な結合により高次構造を認識する蛋白質の結合を効率的に阻害できると期待される。本申請研究では核酸高次構造を選択的にアルキル化する中分子として標的核酸に近接し反応を誘起する部位及び標的核酸構造を認識する部位という２つの異なる機能を合わせ持つハイブリッド型核酸標的プローブの開発を目指している。細胞内で標的高次構造を効率的にアルキル化するには、標的近傍でのみ反応性の高い活性種が発生することが必要とされる。H30年度は、種々のビニルキナゾリン安定前駆体を用い、高次構造に対して結合し活性化される構造について検索を行った。高次構造に結合する部位として、複数の高次構造に結合する分子としてアクリジンを用いた。ビニル基をメチルスルフィド基(SMe)、その酸化体(SOMe)、及びフェニルスルフィド基(SPh)を導入したアクリジン結合型ビニルキナゾリン安定前駆体を合成し、グアニン４重鎖DNA(G4DNA)に対するアルキル化について検討した。その結果、その反応性はSOMe>SPh>SMeであることがわかった。非常に興味深いことに、SPh体は水中で非常に安定であるにもかかわらず、G4DNAに対して高い反応性を示すことがわかった。さらにSPh体は他の高次構造であるT-Tミスマッチ、さらには塩基欠損部位を持つ２本鎖DNA内のチミンに対しても反応することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では核酸高次構造をアルキル化する中分子プローブ開発を目指している。現在までに核酸の高次構造として、塩基欠損部位を持つ２本鎖DNA、T-Tミスマッチ構造を持つ２本鎖DNAさらには４本鎖DNAを標的とする効率的なアルキル化プローブの開発に成功した。さらに今年度は標的近傍でのみ反応性の高い活性種が発生する分子構造の構築に成功した。細胞内には様々な反応活性種が存在することから、今回得られた結果は、細胞内で機能するアルキル化プローブの開発を可能にするものであると考えている。さらに、標的化が難しい、RNAの高次構造に対して結合する分子を探索する方法論についても検討した。RNAの高次構造は非常に多様であることから、それぞれの高次構造に対して結合する分子を設計するのは非常に困難である。そこで今回、プローブが結合できるRNAの高次構造を検索する方法論についても検討した。多種類の高次構造を持つRNAライブラリーを用いて、既知のアクリジン誘導体を用いて検索したところ、非常に興味深いことに４本鎖RNAを取りうる配列が多く観測されることがわかった。この結果からこの方法論はプローブが結合する新たな結合RNA配列大規模解析技術構築に繋がると考えている。さらにこの方法論は従来の方法と異なり、PCRを必要としないため、アルキル化プローブが結合するRNAの高次構造を検索することも可能である。その予備的検討として、前述したアクリジンを持つアルキル化プローブを用いて４本鎖RNAに対するアルキル化について検討した。その結果、アルキル化ではなく、RNAが切断されたバンドが観測された。本プローブは別のRNA高次構造に対してはアルキル化が進行することが確認されている。これらの結果から、このプローブは４本鎖RNAをアルキル化することで、アクリジン誘導体が近接する部分のリン酸基を切断したものと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は下記について検討する。
１）G-4本鎖構造をアルキル化する中分子プローブの開発：昨年度までにG-カルテット構造内で効率的に活性化されるアルキル化中分子プローブを開発した。さらに４本鎖DNAに選択的に結合する結合分子であるテロメスタチン誘導体（共同研究者である長澤和夫博士にご提供頂いた。）をアルキル化部位に結合させたプローブが、４本鎖DNAを選択的にアルキル化することも見出した。今年度は、種々のテロメスタチン誘導体と反応部位を結合させたプローブを合成し、その反応性について検討する。特に4本差DNAのみではなく、４本鎖RNAに対する反応性についても検討する。
２）G-4本鎖RNAを切断するプローブの開発：昨年度、アクリジン誘導体を持つアルキル化プローブがG-4本鎖RNAを選択的に切断することを見出した。本年度はさらにこの詳細な切断機構を検討し、新たなG-4本鎖RNA切断分子の創製について検討する。現在までにG-4本鎖RNAを選択的に切断する分子は知られておらず、非常に興味深いと考えられる。
３）RNA高次構造結合分子の検索：昨年度開発したプローブが結合できるRNAの高次構造を検索する方法論を用いて、新規プローブが結合するRNAの高次構造を検索する。さらにアルキル化プローブが結合するRNAの高次構造について検索する方法論を確立し、効率的に、RNAの高次構造をアルキル化する新規プローブの開発を目指す
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