| 研究領域 | 生物の３Ｄ形態を構築するロジック |
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| 研究課題/領域番号 |
15H05863
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
松野 健治 大阪大学, 理学研究科, 教授 (60318227)
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| 研究期間 (年度) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 発生・分化 / 細胞・組織 |
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| 研究実績の概要 |
ショウジョウバエの後腸は左ネジ捻転して左右非対称化するが、この現象は、繊毛に依存した脊椎動物の左右非対称性形成とは異なる機構で起こる。後腸上皮細胞が後腸捻転を誘発することがわかっていたが、その機構は不明であった。三次元（3D）モデル後腸での捻転のシミュレーションから、個々の3D細胞の頂端面と基底面の間の「ねじれ」と後腸捻転が連動することが計算で示された。さらに、現実の後腸でも、このねじれが観察できた。しかし、細胞のねじれが形成され、それが後腸の捻転に変換されていく、ねじれによる後腸捻転の機構は不明である。本研究計画では、これまでの遺伝学的手法に加えて、in vivo 3Dライブイメージングと3Dシミュレーションを併用することで、後腸の左ネジ捻転を誘発する細胞レベル、分子レベルの機構を理解することを目的とする。この目的を達成するために、平成30年度において次の(1)、(2)の研究を実施し、それぞれで述べた成果を得た。
(1) 後腸上皮細胞のねじれを定量的に解析する
平成29年度までの研究において、野生型胚の後腸上皮の3Dタイムラプスイメージをもとにして、後腸上皮細胞のねじれを定量的に解析する方法を確立していた。平成30年度の研究において、得られたデータを統計的に解析した。その結果、現在の細胞のねじれの計測・計算法では、後腸上皮細胞のねじれの値にばらつきが大きく、統計的に有意なデータが得られていないことがわかった。一つの原因は、3Dタイムラプスイメージから得た細胞形態の座標データの誤差が大きいことであった。
(2) 個々のモデル上皮細胞のねじれによって3Dモデル後腸の捻転を誘発する
3D後腸コンピュータ・モデルにおいて、モデル上皮細胞にねじれを導入することで、3Dモデル後腸をin vivoと同程度に捻転させる各種条件を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでの研究で、後腸の捻転が誘発される機構を理解するために、3Dモデル後腸で捻転を再現し、それに必要な上皮細胞の挙動の予測を試みた。その結果、後腸の捻転は、円柱上皮細胞のねじれとして検出される細胞キラリティによって起こっている可能性が示唆された。平成30年度の研究では、次の(1)、(2)の研究を実施し、それぞれで成果が得られたが、問題点も見いだされた。問題解決の方針は立ったが、研究の進展はやや遅れることとなった。その判断の根拠を以下に示す。
(1) 後腸上皮細胞のねじれを定量的に解析する
後腸捻転の過程で起こる後腸上皮細胞のねじれを、3Dタイムラプス撮影することで解析した。後腸上皮細胞の頂端面はDE-cadherin-GFP、側面と基底面はDiscs large-GFP用いて可視化することで、明瞭な3Dタイムラプス映像を取得した。平成28年度において、3Dタイムラプスのデータから細胞のねじれを算出する方法を開発し、平成29年度に多量のデータを取得し、統計的解析を実施した。その結果、3Dタイムラプス映像から得た細胞の座標データの誤差が大きく、細胞のねじれデータが統計的に有意でないことが判明した。
(2) 個々のモデル上皮細胞のねじれによって3Dモデル後腸の捻転を誘発する
3D後腸コンピュータ・モデルにおいて、細胞のねじれによってモデル後腸の捻転を駆動させる条件を検討した。付加条件として、モデル細胞の体積を捻転前後で20％増加させることや、細胞の高さを小さくすることによって、3Dモデル後腸の捻転を誘発すことができた。このような細胞体積の増加、高さの減少はin vivoでも観察されている。また、3Dモデルから、時計、反時計方向にねじれた細胞が混在する場合、多数を占める細胞によって後腸捻転の方向が決まることがわかった。これは、in vivoの状況により近いシミュレーションである。
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| 今後の研究の推進方策 |
後腸上皮細胞のねじれが後腸の管の左ネジ捻転を誘発する機構を、in vivo 三次元（3D）ライブイメージングと3Dシミュレーションを用いて解析する。この目的を達成するために、令和元年度に以下の(1)-(3)研究計画を実施する。
(1) ライブイメージングによる後腸円柱上皮細胞のねじれの定量的解明 平成30年度までに実施したライブイメージングによる後腸円柱上皮細胞のねじれの経時変化の解析から、野生型胚の後腸上皮細胞は、後腸の左ネジ捻転にともなって、基底膜（消化管を外から）からみて時計方向にねじれていくことが示された。しかし、誤差が大きく、後腸上皮細胞のねじれを定量的に理解するには至っていなかった。令和元年度には、細胞のねじれの定量的、経時的パターンを統計的に解析できる計測法を開発する。
(2) 3D後腸上皮コンピュータ・モデルによる後腸上皮細胞のねじれの再現 令和元年度では、(1)の研究で見出したin vivoでの上皮細胞のねじれの定量的、経時的パターンをモデルに反映させる。例えば、上皮細胞の体積変化、異なるねじれ方向を示す細胞の割合などをパラメータとして取り入れ、3D後腸上皮コンピュータ・モデルで捻転を誘発できる至適条件との整合性を検討する。
(3) 後腸円柱上皮細胞のねじれを誘発する機構の解析 後腸円柱上皮細胞のねじれを誘発する機構を明らかにする。後腸上皮細胞のF-アクチンの機能に何らかのキラリティがあると予測しているが、これまでの研究では、これを検出することはできていない。上皮細胞で機械的力を発生しているMyosin IIの動態にキラリティがあると予測し、スピニングディスク顕微鏡を用いて、Myosin II-GFPの動きをex vivoでライブ観察する。Myosin II-GFPの動態をコンピュータ解析することで、Myosin II-GFPが渦巻き運動する可能性を検討する。
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