| 研究領域 | 脂質クオリティが解き明かす生命現象 |
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| 研究課題/領域番号 |
15H05901
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| 研究分担者 |
中川 敦史 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20188890)
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| 研究期間 (年度) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / タンパク質ドメイン / 電位センサー |
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| 研究実績の概要 |
電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPについては、マウスHv1の点変異体を複数作成し、パッチクランプ計測によりアラキドン酸の作用を調べたところ、作用責任部位を単一のアミノ酸に帰することはできなかった。一方C末端側細胞質領域を欠失させた変異体ではゲーティング速度の加速化は認められたが電流-電圧曲線I-Vのシフトが見らなくなった。I-Vのシフトとゲーティングの加速化は異なる部位に依存する可能性が考えられる。
リポソーム再構成系については、どの動物種のオルソログ分子が解析に適するかを検討した。ノイズ解析からの単一チャネル電流量の推定値を比較した結果、ウニ由来SpHv1が最も大きかった。X線結晶化された分子に近いマウス由来Hv1と平行し、SpHv1のタンパク質精製を試みた。
電位依存性ホスファターゼVSPについては、基質であるイノシトールリン脂質の特異的な認識機構を明らかにするため、中川研究分担者とともに、基質存在下でのX線結晶化に取り組み、発現、精製条件の検討を行い、素性の良いコンストラクトを得た。酵素領域で膜に面すると予測される部位に変異導入実験をおこなって、電位依存性酵素活性の計測を電気生理学計測および非天然蛍光アミノ酸であるL-Anapを用いた蛍光測定により行ったところ、PTENと保存性の高い疎水性部位がPBMと基質結合ポケットの間に存在し、これが電位依存性酵素活性に必須であることから、新規の膜相互作用部位であると推定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPへのアラキドン酸作用部位の特定を試みた。C末端側の細胞質領域を欠失させるとI-Vカーブのシフトが生じなくなることから、ダイマー内サブユニット間にアラキドン酸の作用部位がある可能性が示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPについては、ダイマー内サブユニット間の相互作用に注目して解析を進める。
VSPについては、今回見出された新規膜相互作用部位の機能的役割と分子機構を明らかにするため、様々なアミノ酸への置換や、酵素内の様々な部位の構造変化の蛍光計測を行う。この結果を、中川・研究分担者が進めるX線結晶構造が得られれば、その情報と対照する。
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