| 研究領域 | 温度を基軸とした生命現象の統合的理解 |
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| 研究課題/領域番号 |
15H05929
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
今本 尚子 国立研究開発法人理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 主任研究員 (20202145)
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| 研究期間 (年度) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 核ー細胞質間輸送 / 熱ストレス / Hikeshi / Importin / 温度制御実験 / 熱ショックタンパク質Hsp70 |
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| 研究実績の概要 |
HeLa細胞では、Hikeshiをノックダウンして熱ストレスに曝すと生存率が低下してストレス感受性を示すのに対して、HikeshiノックアウトMEF（mouse embryonic fibroblast）細胞は、熱ストレスに曝すと生存率が上がってストレス耐性を示す。このように、Hikeshi欠損で熱ストレス感受性が細胞によって逆になるのは何故かを解析するため、CRSPR/Cas9を利用して、ヒトHeLa細胞（子宮頸がん細胞）とhTRET-RPE1細胞（不死化網膜上皮細胞：正常２倍体細胞）のHikeshiをノックアウトした細胞株を樹立して、そのストレス感受性を調べた。その結果、HikeshiノックアウトHeLa細胞では、熱ストレスに曝すと生存率が下がってストレス感受性を示すが、HikeshiノックアウトhTERT-RPE細胞では、熱ストレスに曝すと生存率が上がってストレス耐性になることがわかった。MG132処理でも同様の逆の現象が見られた。また、生存率と一致して、ストレスでHikeshiをノックアウトするとHeLa細胞ではアポトーシス活性が上昇するのに対して、hTERT-RPE1細胞ではアポトーシス活性が低下する。シグナリング因子を調べると、Hikeshiをノックアウトすることで、転写因子HSF1と癌抑制遺伝子p53の活性に影響が見られることがわかった。
精密な温度制御ができる実験系の樹立をして、細胞内で働く様々な核―細胞質間輸送経路それぞれの温度感受性を調べた。その結果、温度を上昇させると、まずHsp70/Hsc70輸送が駆動し、次にImportinα/β核内輸送が低下することがわかった。他のRan依存的なImportinβファミリー輸送はそれよりも高い温度で低下する。これらのことから、細胞の中で働く核―細胞質間輸送は、温度によって多段階的に制御されることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HeLa細胞を用いた以前の解析から、Hikeshiが欠損すると細胞はストレスダメージから回復せず死滅すると、単純に考えていた。しかし、今年度の研究から、Hikeshiが欠損するとHeLaなどの癌細胞はストレスをかけると生存率が下がったストレス感受性になるが、正常２倍体細胞は、ストレスをかけると逆にストレス耐性になることがわかった。ストレス感受性が逆になるのは、Hikeshiノックアウトによるアポトーシス活性の上昇と低下によるものと考えられる。この現象は、Hikeshiをノックアウトすることでp53の活性が影響を受けることと深く関係すると考える。HeLa細胞でも、hTERT-RPE細胞でも、Hikeshiをノックアウトするとp53の発現が亢進する。HeLaのp53にはtransactivation活性がないが、アポトーシスを誘引する活性を持つことが知られている。一方で、hTERT-RPE細胞では、p53が亢進すると、その下流のp21の発現が強く亢進し、アポトーシス活性を抑制すると考えられる。このように、これまで現象しかわかっていなかったHikeshi機能喪失の影響が、分子レベルで説明できる端緒を掴んだと言える。このことは、Hikeshi機能の分子メカニズムを明らかにする上で大きな進展である。
精密な温度制御が可能な実験系を樹立したことにより、核―細胞質間輸送が温度によって多段階的に制御されるという、新しい概念を創出することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Hikeshiでp53やHSF1の活性が制御されることがわかってきた。このことから、核内Hsp70がp53とHSF１の活性を制御する可能性が考えられる。今後、２因子の活性制御が核内Hsp70の作用であることを証明するとともに、制御の分子メカニズムを明らかにして行く。これまでわかってきたHikeshiの機能喪失に伴う様々な現象が引き起こされるメカニズムの解析が進むと期待できる。
Hikeshiの機能が喪失すると、生体に様々な影響が見られ、Hikeshiの重要性がわかる。一方で、Hikeshiの活性化メカニズムは不明であり、明らかにしなければいけない重要な問題である。今年度の温度制御の実験から、Hsp70が駆動する核内輸送の温度が、タンパク質が一般的に変性する温度よりも低い特定温度であることがわかった。この特定温度で、Hsp70とHikeshiタンパク質が結合するのではないかと考える。Thermal shift assayなどを用いて、Hsp70とHikeshiタンパク質の温度変化による物理化学的性質を調べることで、その可能性を探る。
核-細胞質間輸送を担う異なる輸送経路のそれぞれが、異なる温度を感知して輸送活性を変化させることがわかってきた。感知のメカニズムを明らかにしていく。中でも、Ran依存的なImportinファミリー輸送経路の中では、Importinα/β輸送経路が他の輸送経路に比べて低い温度で抑制される。この輸送経路に特異的なImportinαに焦点をあて、温度で変化する物理化学的特性を調べる。また、核-細胞質間輸送が温度によって多段階的に制御されることの生理的意義を明らかにする。
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