染色体軸－ループ構造（染色体3D構造）に基づく減数分裂期の染色体機能の制御

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: 染色体オーケストレーションシステム
• 研究課題/領域番号: 15H05973
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 篠原 彰 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (00252578)
• 研究分担者: 篠原 美紀 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (80335687)
• 研究期間 (年度): 2015-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: 染色体OS / 減数分裂 / 染色体 / コヒーシン

研究実績の概要

染色体が調和して機能する仕組みを染色体オーケストレーションシステム（染色体OS） と呼び、精子、卵子などの配偶子形成に必須な減数分裂期のゲノムは染色体OSがより劇的に変化する場である。減数分裂期では染色体3D構造が大きく変化するだけでなく、染色体場で組換えなどの様々なDNA代謝反応が“制御された形”で起き、その制御プラットフォームが染色体OSであると考えられる。減数分裂期染色体を染色体OSのモデル系として捉え、減数分裂期染色体構造、特にその基盤となる軸―ループ構造の構造を理解し、減数分裂期特異的染色体上で起きる減数分裂期の組換えの制御の仕組みを分子レベルで明らかにすることを目的とする。特に減数分裂期の染色体構造、特に高次構造を明らかにし、染色体構造とその上で起こる組換えの連携の分子メカニズムを解明することを目的としている。減数分裂期染色体の軸構成要素であるコヒーシンの動態を中心にその局在の変化と、C(Hi-C)法(A02班白髭／伊藤との連携)などのゲノムワイド構造解析方法を用いて、構造変換に関して解析を行っている。これまで減数分裂期の軸構成要素のコヒーシン複合体が分裂期の切断とは異なる仕組みで、染色体から解離すること、その解離には特異的なリン酸化酵素Polo-likeキナーゼ(PLK)が必要であること、その際に染色体がコンパクトに構造変換をすることを明らかにした。染色体構造変換に関しての新しいメカニズムを提示できる可能性がある成果と言える。また、新規の分担者（篠原美紀；現、近畿大学農学部）を増やすことで、酵母のみならず、高等真核生物での染色体OSと染色体機能の連携についての解析を始めた。特に、ヒト細胞のM期染色体の構造変化がDNA修復に与える影響について解析している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまで減数分裂期の軸構成要素のコヒーシンの減数分裂期の動態を、特に分裂期に切断を受ける、減数分裂期特異的構成要素Rec8に着目して、蛍光染色法を使い、その局在を解析してきた。その結果、Rec8を含むコヒーシンが減数分裂期第１分裂期後期に、その切断なしにその局在を変化させることを見出した。この変化は、Rec8を含むコヒーシンの解離であり、その解離にはRec8の切断を伴わないことをクロマチン分画法で確認した。また解離したRec8はクロマチン分画のものよりも、ゲル上でバンドシフロしていることから、リン酸化を受けることが予想できる。実際に、Rec8の解離にはPolo-likeキナーゼ(PLK)とコヒーシン構成要素Rad61/Waplが必要であることも分かった。PLK により、Rec8はすでにリン酸化されることが報告されている一方、我々の解析からRad61もPLKに依存してリン酸化されることが分かった。これらRec8とRad61のリン酸化が、切断に非依存的なコヒーシンの解離を促進させると考えている。

今後の研究の推進方策

PLKによるRad61やRec8のリン酸化がコヒーシンの解離に必要かどうかをリン酸化サイトのrec8, rad61変異体を作成しして、染色体でのコヒーシンの局在を解析することで検証する。また、減数分裂期のRec8コヒーシンの局在を超高解像度蛍光顕微鏡(3D-SIM；スイスFMI, Gasser教授との共同研究)を用いて精密に解析する。これまで3C(Hi-C)法(A02班白髭／伊藤との連携)などのゲノムワイド構造解析方法を用いて、減数分裂期の染色体のコンパートメント構造を明らかにする解析を継続することに加えて、上記のコヒーシンを主として染色体動態の解析を行う。特に研究室で準備した抗Rec8抗体を用いたクロマチン免疫沈降～シークエンス (ChIP-seq) 法を実施する。時間毎のRec8コヒーシンのゲノム上の分布の変化を見るために、インターナルコントロールとして、他の酵母細胞（ワイン酵母）を用いる。この方法はオーストリア、ウィーン大学のKlein教授との共同研究を予定している。これらの複数の手法により、減数分裂期染色体の動的変化を詳細に記載する。加えて、このような動的な変化が染色体機能にどのような影響を与えるかも同時に検討する。

研究成果

• [国際共同研究] Friedrich Mercher Institute(スイス)
  • 国名: スイス
  • 外国機関名: Friedrich Mercher Institute
• [国際共同研究] IISER Thiruvananthapuram(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: IISER Thiruvananthapuram
• [国際共同研究] Chung-Ang University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Chung-Ang University
• [国際共同研究] University of Vienna(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: University of Vienna
• [国際共同研究] University of California, Davis(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of California, Davis
• [国際共同研究]
  • 他の国数: 3
• [雑誌論文] Modulating crossover frequency and interference for obligate crossovers in Saccharomyces cerevisiae meiosis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Chakrabotty, P., Ajith, VP.., Chen, K., Duttta, A., Krishnaprasad G.N., Tekkedil, M.M., Shinohara, A., Steinmetz, L. M., and Nishant, K.T.
  • 雑誌名: G3(Bethesda) 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: doi: 10.1534/g3.117.040071.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Rad61/Wpl1(Wapl), a cohesin regulator, controls chromosome compaction during meiosis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Challa, KK., Lee, MS., Shinohara, M., Kim, K.M and A. Shinohara.
  • 雑誌名: Nuclei. Acids Res. 巻: 44 ページ: 3190-3203
  • DOI: 10.1093/nar/gkw034
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The Paf1 Complex Shapes the Landscape of Double-strand Breaks along Meiotic Chromosomes in Saccharomyces cerevisiae. (2016)
  • 著者名/発表者名: Santosh, G. K., Patel, K.J., Colletti M.M., Sasanuma, H., Shinohara, M., Hochwagen, A., and A. Shinohara.
  • 雑誌名: Genetics 巻: 202 ページ: 497-512
  • DOI: 0.1534/genetics. 115.177287
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Chromosome synapsis alleviates Mek1-dependent suppression of meiotic DNA repair. (2016)
  • 著者名/発表者名: Subramanian, V.V., MacQueen, A. J., Vader, G., Shinohara, M., Borde, V., Shinohara, A. and A. Hochwagen,
  • 雑誌名: PLoS Biology 巻: 14 ページ: e e1002369
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.1002369.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Gamma-irradiated quiescent cells repair directly induced DSBs but accumulate persistent DSBs during subsequent DNA replication (2016)
  • 著者名/発表者名: Minakawa, Y., Atsumi, Y., Shinohara, A., Murakami, Y., Yoshioka, K.I.
  • 雑誌名: Genes-to-Cells 巻: 21 ページ: 789-797
  • DOI: doi: 10.1111/gtc.12381
  • 査読あり
• [雑誌論文] The MRX Complex Ensures NHEJ Fidelity through Multiple Pathways Including Xrs2-FHA-Dependent Tel1 Activation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki D, Hayashihara K, Shima H, Higashide M, Terasawa M, Gasser SM, Shinohara M.
  • 雑誌名: PLoS Genetics 巻: 12 ページ: e1005942
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005942
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Budding Yeast SLX4 Contributes to the Appropriate Distribution of Crossovers and Meiotic Double-Strand Break Formation on Bivalents During Meiosis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Higashide M, Shinohara M.
  • 雑誌名: G3(Bethesda) 巻: 6 ページ: 2033-2042
  • DOI: 10.1534/g3.116.029488.
  • 査読あり
• [雑誌論文] RPA Mediates Recruitment of MRX to Forks and Double-Strand Breaks to Hold Sister Chromatids Together. (2016)
  • 著者名/発表者名: Seeber A, Hegnauer AM, Hustedt N, Deshpande I, Poli J, Eglinger J, Pasero P, Gut H, Shinohara M, Hopfner KP, Shimada K, Gasser SM.
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 64 ページ: 951-966
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.10.032
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Prophase pathway for removal of a meiosis-specific cohesin from arms of chromosomes during late prophase I of meiosis (2016)
  • 著者名/発表者名: A. Shinohara
  • 学会等名: Chromosome stability meeting
  • 発表場所: Trivandrum, India
  • 年月日: 2016-12-13 – 2016-12-18
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Prophase pathway for removal of a meiosis-specific cohesin from arms of chromosomes during late prophase I of meiosis (2016)
  • 著者名/発表者名: A. Shinohara
  • 学会等名: Gordon Research Conference on Meiosis
  • 発表場所: New London, NH, USA
  • 年月日: 2016-06-03 – 2016-06-08
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Control of meiotic recombination by Rad51/Dmc1 mediators and DNA helicases (2016)
  • 著者名/発表者名: A. Shinohara
  • 学会等名: Abcam meeting on Mechanism of recombination
  • 発表場所: Alicante, Spain
  • 年月日: 2016-05-19 – 2016-05-23
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 大阪大学 蛋白質研究所 篠原研究室
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/genome/index.html
• [備考] 新学術領域、染色体OS
  • URL: http://www.chromosomeos.com