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遺伝情報を担う染色体では様々な反応が調和して起こることにより、染色体が安定に維持され、倍加し、娘細胞へと分配されていく。しかしその詳細は未だ分からない部分が多く、染色体がその構造を維持しながらどのように倍加して行くのか、そして他の染色体動態とどのように連携するのかを解明することを本研究の目的としている。この目的を達成するため、本研究では主として出芽酵母の精製タンパク質から再構成したin vitro DNA複製系を用いる。このin vitro系の複製開始効率はまだ低く、この系の効率を上げるための複製開始機構の解析を行った。また、この系を用いたDNA複製と染色体動態の連携に関する研究を行なった。
まず、解析手段としてin vitro複製系を容易に使えるようにするため、ビオチン化dUTPの取り込みを複製の指標とする系を確立した。また、in vitro系に加える各複製タンパク質の量の最適化を行なった。さらに、複製開始タンパク質のSld3-Sld7がヘテロテトラマーとして働くことの意味の解析を行なったが明確な解は得ていない。一方、昨年度に確率したクロマチンを鋳型とした場合の解析も行なったが、裸のDNAと大きな差は得られていない。
DNA複製と連携する系として、姉妹染色体を繋ぎ止めるコヒーシンと複製フォーク停止機構の解析を行った。出芽酵母のコヒーシン複合体の精製を始めたが、複合体の安定性は低く、精製には至っていない。フォークの停止に関しては、rDNAにあるReplication fork block (RFB)を用いて研究を進めている。RFBにFob1が結合するとFork protection complexに依存して方向依存的に複製フォークの停止が起こる。この系にはRrm3というヘリカーゼも関与するので、このヘリカーゼも精製し解析に用いた。CMGヘリカーゼの停止は起こらないものの、これらをin vitro複製系に加えると、方向依存的なフォークの停止が観察された。
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