| 研究領域 | 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学 |
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| 研究課題/領域番号 |
16H06446
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
南 篤志 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40507191)
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| 研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | 天然物 / 生合成 / 酵素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、ポリケタイド系天然物の生合成マシナリーをリデザインして潜在的生物活性ポリケタイドを創製することを目的とする。具体的には、①数ある天然物生合成酵素の機能解析の中でも最難関の課題の一つとして位置づけられている骨格構築酵素PKS(-NRPS)の反応制御機構の解明と自在な機能制御、②修飾酵素の精密機能解析とそれを利用したポリケタイド鎖の構造多様化、③生合成システムの人為的再構築による複雑骨格多官能性分子の酵素合成の実現に取り組む。
昨年度までの３年間は、主に①と②について検討してきた。その結果、１）CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-Associated Proteins 9）システムによるゲノム編集技術を利用した遺伝子導入法の確立、２）項目１を利用したin vivoでのドメイン交換法の確立、３）他起源由来の骨格構築酵素遺伝子や修飾酵素遺伝子の機能解析、などに成功してきた。その成果は、16報の原著論文（化学系のトップジャーナル3報）、4報の解説記事などとして発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ドメイン交換実験では、１）注目するPKS-NRPS間の相同性が高い方が良い、２）ドメインの連結部位は酵素活性に影響を与える、３）エキソン配列の利用が望ましい、などが指摘されている。以上を考慮し、確立したin vivoでのドメイン交換法を用いてKS-DH部とNRPS部の交換実験を行った。その結果、１）KS-DH部の交換（identity 60%）では活性の消失し、２）NRPS部の交換（identity 50%）では活性の著しく減少した。適切な酵素を用いなければドメイン交換実験は成功しないと考え、公開データベースに登録されている全てのPKS-NRPSを収集・解析した。その結果、意外なことに、１）同一のPK鎖を与えるPKS-NRPSであっても相同性が低い場合があること、２）PKS-NRPSの系統学的な分類結果は生成物の環構造を反映していることがわかった。先行研究の結果と照らし合わせると、同一のクレードに分類されており、かつ、相同性が高い場合にドメイン交換実験が成功していた。これより、本手法が研究対象の選択に有効であることがわかった。一方、本手法を他起源由来の骨格構築酵素遺伝子や修飾酵素遺伝子の機能解析に応用することで、キノコが生産するerinacine生合成に関わる修飾酵素の機能解析などに成功した（A02班との共同研究）。
骨格構築酵素の機能解析では若干の遅れがあるが、①ドメイン交換実験に適した酵素の選択方法に対する明確な指針がえられたこと（投稿準備中）、②予備的な検討を進めているHR-PKSの解析では端緒となる実験結果がえられつつあること、③構造多様化へ向けた他起源由来の天然物生合成酵素遺伝子の機能解析では着実に研究成果が得られていること（原著論文5報）、④他班との共同研究が成果として結実していることなど（原著論文2報）から、本研究は概ね順調に進展しているものと判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の検討（ドメイン交換実験、インフォマティクス解析）から、PKS-NRPSでのドメイン交換では適切なテンプレートの選択が重要であることがわかった。同様のインフォマティクス解析をHR-PKS（PKS-NRPSのPKS部に相当）で行ったところ、ポリオール型PK鎖を与えるグループがドメイン交換実験などにも応用可能なグループであることがわかった。そこで、最終年度はこのグループのPKSを集中的に解析し、PKSのプログラミング機構の解明を目指す。
また、確立した遺伝子導入法は、他起源由来の生合成酵素（チトクロームP450、転移酵素、環化酵素など）の機能解析を迅速に行う上でも効果的である。最終年度は他班との連携をより強化して、興味深い化学反応を触媒する生合成酵素遺伝子の機能解析を積極的に進める予定である。
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