モデル宿主を用いた有用物質生成過程の包括的な解析

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学
• 研究課題/領域番号: 16H06447
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 池田 治生 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (90159632)
• 研究分担者: 小松 護 北里大学, 感染制御科学府, 講師 (40414057)
• 研究期間 (年度): 2016-06-30 – 2021-03-31
• キーワード: ゲノム / 応用微生物 / 抗生物質 / 発現調節 / バイオテクノロジー

研究実績の概要

これまで異種遺伝子発現用に開発してきたStreptomyces avermitilisの汎用宿主は多くの異種二次代謝産物生合成遺伝子群の発現ならびにそれらの生産が効率的であることを確認してきた。効率良い物質生産は生合成遺伝子群の発現のみならず、前駆体として利用される1次代謝産物の供給との同調が極めて重要であることから、本汎用宿主の代謝フラックス解析の構築を行った。また、前駆体の主代謝経路として解糖系、ペントースリン酸系、およびTCA回路までの代謝系の必須遺伝子ではない遺伝子破壊株の網羅的な取得を試みている。代謝フラックス解析は13C-グルコースを取り込ませ、培養時間毎の菌体に取り込まれたタンパク質中のアミノ酸の炭素の取り込みから、代謝フラックスを解析した。Streptomycesでの代謝フラックスの結果は殆ど得られていないため、他のStreptomycesとの比較は不可能であるが、培養初期(対数増殖前期から後期)にかけては解糖系の代謝が60%以上であったのに対し、培養後期(対数増殖後期以降)はペントースリン酸系の代謝が50%以上で進んでいることが明らかとなった。一方、各種代謝系欠損株の取得に関しては多くのこれら代謝遺伝子がオペロンを形成していることから欠失させる遺伝子以降の転写を停止させない欠失株(in-frame deletion)の作製が必須であった。操作を簡便化するため欠失させる遺伝子の上流と下流の領域とloxPに夾まれた耐性遺伝子、ベクターをGibson's assembleの改良法によって効率良く破壊カセットの作製が完了させることができた。これまでに合計10遺伝子程度のin-frame deletion株を作製した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々がこれまで開発した2次代謝産物生合成遺伝子群の異種発現のための汎用宿主Streptomyces avermitilisに関してその代謝フラックス解析系を構築することができた。Streptomycesでの代謝フラックスはほとんど報告がないことから、本菌での特異な代謝パターンが理解することができた。一方、主代謝経路の欠失株の作製を簡便に行う系を確立し、これまで10株程度の欠失株(in-frame deletion)を作製するに至った。この方法は単に代謝に関する遺伝子の欠失株を作製するだけでなく、他の遺伝子も、特にオペロンを形成している遺伝子群に対して、欠失させる遺伝子以降の転写を停止させずに作製することが容易に達成することができる。これらの技術は今後のゲノム編集にも適用可能と考えられる。

今後の研究の推進方策

汎用宿主の代謝フラックス解析が可能となり、かつ主代謝系の欠失株が得られたことから、実際に異種生合成遺伝子群をこれらの欠失株に導入し、代謝産物の蓄積量が改善されたものについて代謝フラックス解析などを行っていく。また、欠失株に関しては単にsingle knockoutだけでなく、いくつかの多重欠失株での代謝産物生成ならびにフラックス解析を行って行きたい。2次代謝産物の中でもラクトン型ポリケチドとペプチド化合物はそれらの生物活性の多様性が極めて興味ある一群である。これらの生合成酵素は多機能酵素によって合成されるが、活性型の酵素は翻訳後修飾によってACP(or PCP)のSer残基にPptA酵素によってホスホパンテテイン残基が導入される。PptAは多くのorthologがあり、そのPptAがこれらの翻訳後修飾に関わっているかは不明である。汎用宿主でのin-frame欠失株は容易に作製出来るため、これらの酵素の遺伝子のsingle, double, triple, quadruple変異体を作製し、それぞれの修飾に関与する酵素の遺伝子を明らかにしていく。

研究成果

• [雑誌論文] Heterologous production of kasugamycin, an aminoglycoside antibiotic from Streptomyces kasugaensis, in Streptomyces lividans and Rhodococcus erythropolis L-88 by constitutive expression of the biosynthetic gene cluster (2017)
  • 著者名/発表者名: Kasuga, K., Sasaki, A., Matsuo, T., Yamamoto, C., Minato, Y., Kuwahara, N., Fujii, C., Kobayashi, M., Agematsu, H., Tamura, T., Komatsu, M., Ishikawa, J., Ikeda, H., Kojima, I.
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s00253-017-8189-5 (2017)
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Complete genome sequence and expression profile of the commercial lytic enzyme producer Lysobacter enzymogenes M497-1 (2017)
  • 著者名/発表者名: Takami, H., Toyoda, A., Uchiyama, I., Itoh, T., Takaki, Y., Arai, W., Nishi, S., Kawai, M., Shin-ya, K., Ikeda, H.
  • 雑誌名: DNA Res. 巻: 24 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1093/dnares/dsw055
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hydroxylation of compactin (ML-236B) by CYP105D7(SAV_7469) from Streptomyces avermitilis (2017)
  • 著者名/発表者名: Yao, Q., Ma, L., Liu, L., Ikeda, H., Fushinobu, S., Xu, LH.
  • 雑誌名: J. Microbiol. Biotechnol. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.4014/jmb.1610.10079.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Dissection of goadsporin biosynthesis by in vitro reconstitution leading to designer analogues expressed in vivo (2017)
  • 著者名/発表者名: Ozaki, T., Yamashita, K., Goto, Y., Shimomura, M., Hayashi, S., Asamizu, S., Sugai, Y., Ikeda, H., Suga, H., Onaka, H.
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 8 ページ: 14207
  • DOI: 10.1038/ncomms14207
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Characterization of giant modular PKSs provides insight into genetic mechanism for structural diversification of aminopolyol polyketides (2017)
  • 著者名/発表者名: Zhang, L., Hashimoto, T., Qin, B., Hashimoto, J., Kozone, I., Kawahara, T., Okada, M., Awakawa, T., Ito, T., Asakawa, Y., Ueki, M., Takahashi, S., Osada, H., Wakimoto, T., Ikeda, H., Shin-ya, K., Abe, I.
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 56 ページ: 1740-1745
  • DOI: 10.1002/anie.201611371
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Natural products discoveryfrom microorganisms in the post-genome era (2017)
  • 著者名/発表者名: Ikeda, H.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 81 ページ: 13-22
  • DOI: 10.1080/09168451.2016.1248366
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Substitution of a Single Amino Acid Reverses the Regiospecificity of the Baeyer-Villiger Monooxygenase PntE in the Biosynthesis of the Antibiotic Pentalenolactone (2016)
  • 著者名/発表者名: Chen, K., Wu, S., Zhu, L., Zhang, C., Xizng, W., Deng, Z., Ikeda, H., Cane, DE., Zhu, D.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 55 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b01040
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] High production of a class III lantipeptide AmfS in Streptomyces griseus (2016)
  • 著者名/発表者名: Takano, H., Matsui, Y., Nomura, J., Fujimoto, M., Katsumata, N., Koyama, T., Mizuno, I., Amano, S., Shiratori-Takano, H., Komatsu, M., Ikeda, H., Ueda, K.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 81 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1080/09168451.2016.1238297
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of AvaR1, a butenolide-autoregulator receptor for biosynthesis of a Streptomyces hormone in Streptomyces avermitilis (2016)
  • 著者名/発表者名: Sultan, SP., Kitani, S., Miyamoto, KT., Iguchi, H., Atago, T., Ikeda, H., Nihira, T.
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol. 巻: 100 ページ: 9581-9591
  • DOI: 10.1007/s00253-016-7781-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hydroxylation of flavanones by cytochrome P450 105D7 from Streptomyces avermitilis (2016)
  • 著者名/発表者名: Liu, L., Yao, Q., Ma, Z., Ikeda, H., Fushinobu, S., Xu, LH.
  • 雑誌名: J. Mol. Catalysis. B. Enzymatic. 巻: 132 ページ: 91-97
  • DOI: 10.1016/j.molcatb.2016.07.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] tRNA-dependent aminoacylation of an amino sugar intermediate in the biosynthesis of a streptothricin-related antibiotic (2016)
  • 著者名/発表者名: Maruyama, C., Niikura, H., Izumikawa, M., Hashimoto, J., Shin-ya, K., Komatsu, M., Ikeda, H., Kuroda, M., Sekizuka, T., Ishikawa, J., Hamano, M.
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 巻: 82 ページ: 3640-3648
  • DOI: 10.1128/AEM.00725-16
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Nitrogen oxide cycle regulates nitric oxide levels and bacterial cell signaling (2016)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, Y., Oguchi, H., Kobayashi, T., Kusama, S., Sugiura, R., Moriya, K., Hirata, T., Yukioka, Y., Takaya, N., Yajima, S., Ito, S., Okada, K., Ohsawa, K., Ikeda, H., Takano, H., Ueda, K., Shoun, H.
  • 雑誌名: Sci. Reports 巻: 6 ページ: 2208
  • DOI: 10.1038/srep22038
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Chemical diversity of labdane-type bicyclic diterpene biosynthesis in Actinomycetales microorganisms (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamada, Y., Komatsu, M., Ikeda, H., “Chemical diversity of labdane-type bicyclic diterpene biosynthesis in Actinomycetales microorganisms
  • 雑誌名: J. Antibiot. 巻: 69 ページ: 515-523
  • DOI: 10.1038/ja.2015.147
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 天然物医薬品を生産するStreptomyces属のゲノム構造 (2016)
  • 著者名/発表者名: 池田 治生
  • 雑誌名: ゲノム微生物学会ニュースレター 巻: 13 ページ: 3-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 格別なる贈り物・エバーメクチンの発見から生合成研究まで (2016)
  • 著者名/発表者名: 池田 治生
  • 雑誌名: 学術の動向 巻: 21 ページ: 13-19
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ポストゲノム時代に向けた微生物由来天然物医薬品の探索研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 池田 治生
  • 雑誌名: 化学と生物 巻: 54 ページ: 17-26
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Chemical diversity of labdane-type bicyclic diterpene biosynthesis in Streptomyces (2016)
  • 著者名/発表者名: Ikeda, H.
  • 学会等名: Society for Industrial Microbiologu and Biotechnology
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 2016-07-24 – 2016-07-28
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 有用天然物生産のための異種生合成遺伝子発現系の構築 - 休眠遺伝子の覚醒による物質生産 - (2016)
  • 著者名/発表者名: 池田 治生
  • 学会等名: 第51回天然物化学談話会
  • 発表場所: 越後湯沢
  • 年月日: 2016-07-06 – 2016-07-08
  • 招待講演
• [備考] Genome Project of Streptomyces avermitilis
  • URL: http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp