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本研究では多様な天然物の生産能を有する海綿共生微生物に着目し、その二次代謝産物の生合成経路の解析を進めた。伊豆半島産のチョコガタイシカイメンは強力な細胞毒性活性を示すcalyculin Aを高濃度で含んでいる。その生産菌は難培養性の海綿共生細菌Entotheonellaである。Entotheonellaはcalyculin Aをより低毒性なリン酸化体phosphocalyculin Aとして生産して蓄積している。ひとたび海綿組織に傷害が生じると、脱リン酸化酵素が作動して強毒性なcalyculin Aが生じる。これまでの研究によって、活性化を担う脱リン酸化酵素はEntotheonellaがcalyculin生合成遺伝子クラスター内にコードするCalLであることを明らかにした。本年度はさらに詳細な解析を進め、CalLの酵素活性に必須な金属種の同定を進めた。ICP-MSや比色定量法を用いて解析を進めた結果、銅と亜鉛を含むことが分かり、purple acid phosphatase familyとして初めて見出された中心金属であった。さらにN末端側の配列を詳細に解析したところ、nativeおよびリコンビナント酵素の両方において同じ箇所で切断されていることが分かった。該当領域はペリプラズムへの輸送に関わるシグナルペプチド配列と良い一致を示した。実際にリコンビナント酵素を調製した大腸菌のペリプラズム画分から高純度のCalLを精製した。以上の結果から、難培養性の海綿共生細菌Entotheonellaはphosphocalyculin Aをprotoxinとして生産するとともに、活性化酵素としてCalLをペリプラズムに発現し、両者を区画化するとともに、膜傷害に応じてcalyculin Aへ変換することが明らかになった。これらの成果は異種生産系の確立において重要な知見となる。
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