| 研究領域 | 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学 |
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| 研究課題/領域番号 |
16H06449
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
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| 研究分担者 |
植木 尚子 岡山大学, 資源植物科学研究所, 准教授 (50622023)
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| 研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | 生合成 / リデザイン / 天然物 / 担子菌 / テルペノイド |
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| 研究実績の概要 |
担子菌ウシグソヒトヨタケCoprinopsis cinereaにおける内因性遺伝子の強制発現
C. cinereaを宿主とした異種遺伝子発現を行う準備段階として、まずはC. cinerea自身の遺伝子を強制発現させることを試みた。既に我々は本遺伝子についてcDNAを取得した後にクローニングし、出芽酵母を用いて異種発現させることでその産物がオルセリン酸 (1)であることを報告している。そこでCC1G_05377の上流に強制発現が可能と考えられるb-tublin、EF3、DED19の各プロモーターを配置したプラスミドを構築し、これをC. cinerea 326株に導入した。PCRによって遺伝子導入が確認された変異体をMYG培地にて振盪培養し、その代謝産物をLC-MSにて解析したところ、それぞれ最大で約10倍(pb-tublin)、約100倍(pEF3)、約250倍(pDED1)と野生株よりも生産性の向上したクローンを得ることに成功した。
続いてcop6遺伝子(CC1G_03563)に着目した。本遺伝子はセスキテルペン合成酵素Cop6をコードしており、FPPよりa-cupreneneを生合成することが報告されている。C. cinerea由来のa-cuprenene関連化合物としてはlagopodin類が知られており、加えてlagopodin類がさらに代謝されて生成したと考えられるhytoyol類の構造がつい最近、報告された。しかし、lagopodinおよびhytoyol生合成におけるcop6遺伝子の関与について直接的な証拠はこれまでに得られていなかった。そこでcop6遺伝子についてDED1プロモーターによる強制発現を試みた。得られた形質転換体は、野生株と比較してlagopodin類が約2-3倍、hytoyol類の生産性が約15倍に増加したクローンを見出すことに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Lagopodin類の生合成経路に関して、α-cupreneneが順次酸化されることで生合成されると予想されているものの、これまでに実験的に証明はされていない。そこで、本研究ではlagopodin類の生合成経路の解明を目指した。
研究対象として、lagopodin類を生産し、遺伝子の操作系も確立されているC. cinereaを用いた。C. cinereaのゲノム情報を参照すると、テルペン環化酵素をコードするcop6に隣接して酸化酵素であるシトクロムP450をコードする遺伝子が２つ（cox1、cox2）存在していることが確認された。そこで、本研究ではcop6、cox1およびcox2遺伝子を出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeで異種種宿主発現することや、C. cinereaのこれら遺伝子を破壊することで、lagopodin類の生合成経路について解析した。S. cerevisiaeを宿主としてcop6等を発現させるためのベクターを作製し、形質転換した後、それらの生産物を確認したところ、cop6導入株ではα-cupreneneの生産が観測された。さらに、cop6、cox1およびcox2の共発現株では2の生産が確認されたものの、lagopodin類の産生は確認されなかった。
続いて、C. cinereaのcop6遺伝子等の破壊株を用いてlagopodin類が生産されるか調べたところ、cop6破壊株ではlagopodinの生産は確認されなくなったものの、cox1やcox2破壊株ではlagopodin類の生産は依然として観測された。そのため、α-cupreneneや2をlagopodin類へと酸化する酵素がcox1およびcox2以外にもC. cinereaにコードされていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回の研究成果によって、キノコを用いリード化合物の探索および大量生産という２大課題を同時に達成できる高い技術に手が届いたと言えるであろう。キノコ類に関しては、単離されてきた天然物の化学構造を眺めてみると糸状菌由来天然物と類似した分子も見受けられるが、その生合成起源および生合成経路が不明瞭な分子も少なくない。このような分子は糸状菌とは異なる生合成遺伝子・酵素から生合成されていると予想できる。本法論を用いて未開拓のキノコを調査することで数多くの新規成分の発見が期待できる。
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