| 研究領域 | 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学 |
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| 研究課題/領域番号 |
16H06453
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
葛山 智久 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30280952)
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| 研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | Biosynthesis / nucleoside antibiotic / carbazole / terpene / reaction mechanism |
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| 研究実績の概要 |
特徴的な核酸塩基である2-アミノプリン構造と、アミノウロン酸骨格からなるヌクレオシド系抗生物質、アミプリマイシン（APM）とミハラマイシン（MHM）の生合成機構の解明を目指した。まず、両化合物の生産菌である放線菌Streptomyces novogenniensisとStreptomyces miharaensisのゲノムシーケンス解析を行い、得られたゲノムシーケンスを比較することで生合成遺伝子クラスターを同定した。さらに、このようにして見出された候補領域をStreptomyces albusに導入し、さらに、遺伝子クラスター中の転写制御因子を高発現させることでAPMの生産量が野生株の約30倍まで増加した株を育種することに成功した。次に、13C安定同位体標識したグルコースのトレーサー実験により、APMにおける分枝糖骨格は、ポリケチド合成酵素PKSと非リボソームペプチド合成酵素NRPSによって生合成されることを明らかにした。また、APMに含まれる特殊アミノ酸シスペンタシンと分枝糖間のペプチド結合形成反応を触媒する酵素と、MHMの当該酵素のホモログを同定した。さらに、これらの酵素を用いた変換実験により、新奇な2-アミノプリン含有化合物を創出することにも成功した。
カルバゾールアルカロイドであるカルキノスタチンAのCqsB生合成遺伝子クラスターを同定し、生合成経路の全容を解明した。次いで、X線結晶構造解析によって生合成の鍵酵素の１つであるCqsB2の立体構造の解明にも成功し、その構造に基づきCqsB2の詳細な反応機構を提唱した。さらに、CqsB1, CqsB2, CqsB3に対して様々な基質を検討し、2つの新規カルバゾール化合物を創出することにも成功した。
Trichoderma atroviride FKI-3849のゲノム配列から、隠れマルコフモデルを用いて機能未知のテルペン合成酵素を見出し、新規セステルペン、トリコブラシレノールを同定した。さらに、同位体標識基質を用いてその複雑な形成機構を提唱した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに本研究課題で発見した新奇天然化合物、メチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行い、昨年度までに、各種組換え酵素の組み合わせを変えることで、個々の酵素の機能を明らかにすることができた。したがって、ここまでは順調に進展していると判断した。しかしながら一方で、ベンゼン環を生成する鍵酵素をコードする生合成遺伝子を同定することはできたものの、その酵素の基質を同定することや、単独での酵素活性を検出するには至っていない。この点については、昨年度中に解決する予定であったが叶わなかった。そこで、今年度は、これまでに機能を明らかにすることができたポリケチド合成酵素を用いて、試験管内で生合成中間体を合成して調製し、その中間体と組換え酵素とを反応させ反応産物を同定することで、このベンゼン環の新規な形成反応を解明することを計画している。安定に生合成中間体が生産できなければ、推定基質をいくつか化学合成することも考えている。
その他の放線菌が生産する生物活性物質である、JBIR-68、A-94964、カプラザマシン、フェナジノマイシン、ナフテルピン、フラキノシンの生合成経路の解明については、JBIR-68の生合成の鍵酵素であるプレニル基転移酵素の同定に想定以上の時間がかかっている以外は、概ね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、これまでに本研究課題で発見した新奇天然化合物、メチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行う。昨年度までに、各種組換え酵素の組み合わせを変えることで、どのポリケチド合成酵素が、どこまでの炭素鎖長まで伸長することができるのか、また、どの酵素が還元や脱水反応に必要なのかを明らかにすることができた。一方で、ベンゼン環を生成する鍵酵素をコードする生合成遺伝子を同定することはできたものの、その酵素の基質を同定することや、単独での酵素活性を検出するには至っていない。そこで、今年度は、これまでに機能を明らかにすることができたポリケチド合成酵素を用いて、試験管内で生合成中間体を合成して調製し、その中間体と組換え酵素とを反応させ反応産物を同定することで、このベンゼン環の新規な形成反応を解明する。以上の結果をまとめて論文とする。
放線菌が生産するヌクレオシド系化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を引き続き進める。具体的には、JBIR-68、A-94964、カプラザマシンなどの生合成の精密解析を進める。また、放線菌が生産するフェナジノマイシン、ナフテルピン、フラキノシンなどのメロテルペノイド生合成経路における特異的な生合成反応について、組換え酵素を用いたin vitro反応を詳細に解析する。個々の生合成反応で必要となる基質については、それぞれの遺伝子破壊株を作製し、その遺伝子破壊株が蓄積する生合成中間体を精製することで調製する。生合成経路の全容が解明できたものから、論文としてまとめる。
共同研究者である東北大学薬学部の浅井貞吾教授から供給いただいたポリケチド合成酵素の詳細な機能解明を進める。そのため、現在、結晶化に成功している酵素のX線構造解析をさらに進めることで、その特異な反応機構を明らかにする。
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