| 研究領域 | 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学 |
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| 研究課題/領域番号 |
16H06454
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
山崎 真巳 千葉大学, 大学院薬学研究院, 准教授 (70222370)
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| 研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | 生合成 / アルカロイド / カンプトテシン / トランスクリプトーム / メタボローム |
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| 研究実績の概要 |
植物における生物活性物質生合成のゲノム進化の分子基盤を明らかにし、得られる知見を合理的な生合成リデザインに応用することを目的として、具体的には抗がん性アルカロイドカンプトテシンならびに構造と活性の多様性に富むリジン由来アルカロイドの生合成について次のような研究を行った。
（１）アルカロイド生産植物の比較トランスクリプトーム解析による生合成遺伝子の推定：カンプトテシン生産植物である、チャボイナモリ、クロイワイナモリ、キジュおよびクサミズキについてそれぞれ数この組織を用いてde novo RNA-seq解析を行った。得られたraw dataをCLC, Trinityあるいは SOAP de novoによりアセンブリし比較評価した。さらにこれらを統合して得られたunigeneについてBLAST検索によるアノテーションを行い経路ごとの共発現解析等を行った。（２）メタボローム解析による生合成中間体の推定:リジン由来アルカロイドについて鍵酵素を導入発現させた形質転換体の比較メタボローム解析により生合成中間体を推定した。またカンプトテシン生合成についてランスクリプトーム解析に用いた組織についてLC-MSによる網羅的メタボローム解析を行った。これらの解析を行うために高速液体クロマトグラフシステムを購入した。（３）メタボロームデータとトランスクリプトームデータの統合解析：カンプトテシン生合成について生合成反応機構ならびに生合成中間体を推定した。（４）組換えタンパク質を用いたin vitro機能解析：アルカロイド生合成に関与すると推定される遺伝子について酵母で組換えタンパク質を発現させin vitro酵素活性測定を行った。酵母ならびに植物細胞で発現させた組換えタンパク質を効率よく抽出するために高圧バッジ式ホモジナイザーを購入した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、高速液体クロマトグラフシステムを購入しこれに既存の質量分析計を接続したLC-MSによるメタボローム解析装置をセットアップした。これを用いてカンプトテシン生産植物ならびに形質転換植物体などのノンターゲットメタボローム解析を行い成果を得ている。また、組換えタンパク質を用いた触媒酵素のin vitroアッセイのためにバッジ式高圧ホモジナイザーを導入した。本装置を用いることにより従来の超音波法より高収率で組換えタンパク質を得ることが可能となった。これらを用いた実験は計画通り順調に進んでいる。生合成反応機構の推定については、遺伝子と代謝物からの生合成経路推定は順調に進んでいる。種横断的解析についてはオントロジー解析を組み合わせた新しい解析方法の開発が必要であるが、これまでに試行した解析結果は良好である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に行ったde novoトランスクリプトーム解析の精度を上げるためには、ゲノム情報を参照する解析が必要であるためチャボイナモリの部分的なゲノム解析を開始する。リジン由来アルカロイドについては公開されたホソバルピナスゲノム情報を利用してトランスクリプトーム解析の精度を改善する。これらを用いて遺伝子マイニングを進める。また、種横断的トランスクリプトーム解析によりアルカロイド生合成のゲノム進化機構を明らかにする。マイニングされた未知遺伝子の機能解析のためチャボイナモリにおけるゲノム編集ならびにインフィルトレーション法による一過性発現の系を立ち上げる。また、従来の組換えタンパク質を用いた酵素機能測定による機能解析を進める。すでにリジン由来アルカロイド生合成の鍵酵素であることが明らかにされているリジン・オルニチン脱炭酸酵素については計算化学に基づいて点変異体を作成し触媒機能を測定することによりタンパク構造と触媒機構の関係を明らかにする。
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