研究領域 | スクラップ&ビルドによる脳機能の動的制御 |
研究課題/領域番号 |
16H06458
|
研究機関 | 京都大学 |
研究代表者 |
鈴木 淳 京都大学, 高等研究院, 教授 (30511894)
|
研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
|
キーワード | 神経 / スクランブラーゼ / 活性化因子 / sgRNA library / ホスファチジルセリン / FACS / 次世代シークエンサー |
研究実績の概要 |
これまでに神経細胞特異的に発現しているスクランブラーゼXkr4において、生きた細胞において恒常的に活性化する変異体を同定している。しかしながらXkr4を活性化させる因子については分かっていない。Xkr4はアポトーシス刺激において活性化させることができるため、死にゆく細胞を用いてスクリーニングを行う必要があるが、スクランブラーゼ活性がなくても細胞は死ぬことができるため通常のスクリーニングでは遺伝子同定ができない。そこで死にゆく細胞を用いても遺伝子同定ができる”Revival screening”の実験系を樹立することにした。まず、アポトーシス時にはDNAが切断されるため、DNaseをノックアウトし切断されないようにした。次に、CRISPR Cas9 sgRNA libraryを導入後、アポトーシス刺激を行い、PSを露出していない細胞をFACSによりソーティングした。この細胞より濃縮されたsgRNA libraryを調製し、再度スクリーニングを行った。この過程を数回繰り返すと、濃縮されたlibraryの導入によりPSの露出を顕著に抑制することができた。そこで、この細胞に組み込まれたsgRNAを次世代シークエンサーで解析し、Xkr4活性化の候補因子を得ることができた。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRISPR screeningによりスクランブラーゼ活性化の候補因子を得ることができたため。
|
今後の研究の推進方策 |
CRISPR screeningによって得られたスクランブラーゼ活性化の候補因子について、その機能を詳細に調べる。
|