| 研究領域 | 新光合成：光エネルギー変換システムの再最適化 |
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| 研究課題/領域番号 |
16H06554
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
高橋 裕一郎 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 教授 (50183447)
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| 研究分担者 |
坂本 亘 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20222002)
田中 亮一 北海道大学, 低温科学研究所, 准教授 (20311516)
伊福 健太郎 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (50359783)
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| 研究期間 (年度) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | 光合成電子伝達系 / プロトンチャネル / 光化学系複合体 / シトクロムb6f複合体 / 光阻害・光損傷修復 / フィードバック制御 / 葉緑体プロテアーゼ / タンパク質リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
自然条件での変動する光環境下における光合成電子伝達活性の制御機構を解明するため、チラコイド・ルーメンの酸性化によるフィードバック制御、光エネルギーの捕集の制御、および光化学系の光損傷と修復に着目して、以下の研究を進めた。（1）チラコイド・ルーメンの酸性化の機構を理解するため、光化学系Ⅱ（PSII）酸素発生系からのプロトンの輸送チャネルの同定を進めた。PSIIの結晶構造から推定されたプロトン輸送に関与する可能性のある葉緑体にコードされたPsbA、PsbB、PsbC、PsbDサブユニット上のアミノ酸を置換した葉緑体形質転換体を作出した。また、核にコードされたPSII酸素発生系の表在性タンパク質（PsbP）のアミノ酸置換のための再構成系の構築も進めた。（2）シトクロムb6f複合体とPSIIの電子伝達活性の制御の解析のため、結晶構造からルーメンの酸性化によりプロトン化する可能性の高いアミノ酸を同定し、そのアミノ酸を置換する準備を進めた。特に、PetA、PetD、PetG遺伝子の形質転換系の開発を進め、4種の形質転換体を作出した。（3）電子伝達系の光損傷と修復に関与する因子の同定のため、光化学系Ⅰ（PSI）複合体の分子集合因子の同定・解析を進めた。PSIの生合成因子として葉緑体にコードされた因子と核にコードされた因子にHAタグを融合した葉緑体および核の形質転換体を作出し、タグを融合した因子をアフィニティー精製し、相互作用するタンパク質の同定を進めた。（4）PSII複合体の合成および光損傷後の修復に関与する因子の解析を進めた。光化学系Ⅱの構築に関わると考えられている因子の精製を行った。さらに、光損傷したPSIIの修復に必須なプロテアーゼの制御作用について、分子レベルでの解析を進め、損傷を受けた反応中心タンパク質の分解過程についての解明を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（1）PSIIのアミノ酸置換した形質転換体の解析から、D1-Asn298がYZの機能に重要であるが、D1-Asn298よりルーメンに近いアミノ酸残基はプロトン排出には関与しないと結論した。一方、D1-Asp61の側鎖の負電荷がプロトンの排出に重要な役割を果たしていることを変異体の解析と量子化学計算から明らかにした。また、in vitro再構成実験とクラミドモナス形質転換系を併用して、PsbPやPsbQとPSIIの相互作用が水分解-酸素発生反応に及ぼす影響を解析し、緑色植物で独自に発達したPsbP, PsbQホモログの機能解明も進めた。（2）シトクロムb6f複合体の結晶構造情報を活用した量子化学計算により、pKaが高い側鎖をもつ酸性アミノ酸をPetA、PetD、PetG上の４残基を特定し、ルーメンの酸性化に伴う電子伝達活性制御への関与を調べるための変異株を作出した。（3）葉緑体にコードされるYcf3が反応中心サブユニットPsaAとPsaBから反応中心複合体を形成する分子集合に必須であること、葉緑体にコードされるYcf4はコア複合体の形成とアンテナ複合体の結合に関与することを明らかにした。（４）PSII光損傷からの修復で迅速なD1分解を担うFtsHプロテアーゼの制御作用について、相互作用因子EngAの解析とFtsH2自身のリン酸化を引き続き解析し、EngAとの相互作用をBiFCで実証し、4箇所推定されたリン酸化部位のアミノ酸置換を行い、S212がFtsHの安定性に関与することを明らかにした。また、クロロフィル結合モチーフをもつLILタンパク質であるOHP1を精製したところ、光化学系IIのコアサブユニットである、D1/D2を含む複合体が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1） PSIIの酸素発生系で精製されたプロトンをチラコイド・ルーメンに放出するプロトンチャネルに関与するアミノ酸を同定するため、D1-Asp61に着目して研究を進める。また、表在性タンパク質（PsbOとPsbP）のプロトン輸送に関与すると予想されるアミノ酸の置換を核形質転換およびin votro再構成系を用いて進める。（2）シトクロムb6f複合体の電子伝達活性を制御すると予想されるPetA、PetD、PetG遺伝子の4種の形質転換体の解析を進め、特に強光条件下でルーメンが酸性化したときに電子伝達反応が受ける影響を調べる。（3）PSI複合体の分子集合に関わる因子でYcf3とYcf4以外の因子（Y3IP1、CGL71など）の機能解析を欠損変異株や相互作用するタンパク質の解明により進める。（4）FtsH2のリン酸化アミノ酸を置換した形質転換シロイヌナズナについて、斑入り変異の相補とFtsHの安定性、PSII活性、D1分解への影響等について解析進める。PSII修復とD1のトリプトファン残基（W14, W317）の酸化の関連性を解明する。既に精製に成功したOHP1複合体の全てのサブユニットが同定できる程度の純度と量が得られるまで、精製を改善する。また、同定されたサブユニットのRNAiによるノックダウンによる機能解析を進める。
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