計画研究
オルガネラ間の脂質輸送は異なるオルガネラ同士の接触する特殊なゾーン（オルガネラ連携ゾーン）において脂質輸送タンパク質群が実行していることが生物種を問わず多様な脂質種で広く明らかになってきた。しかし、その詳細な分子機序や実際に輸送の起こっているゾーンの可視化、この連携ゾーンが生物個体の生存戦略に果たす役割などは未解明である。平成29年度7月に発足した新学術領域研究「細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読」の研究計画班の一つとして当研究班では、小胞体とゴルジ体もしくは葉緑体との間の機能連携およびその制御の分子機序を脂質輸送の観点から研究している。平成29年度の成果として、（１）動物細胞において小胞体からゴルジ体へとセラミドを輸送するタンパク質CERTが多重リン酸化によって抑制制御される機序の一端を原子レベルで解明した。(2) 植物細胞のリン酸欠乏適応において重要な役割を担うホスファチジン酸脱リン酸化酵素PAHは、通常生育条件下のシロイヌナズナでは主に細胞質に局在していて、リン・窒素欠乏ストレス時には葉緑体表層（内部）に多く局在するようになることを疑似超解像法を駆使して明らかにした。(3) 異なるオルガネラの連携ゾーンを超解像イメージングするための条件を様々な試行錯誤を実施して設定した。ここで設定した超解像イメージング条件は今後の本計画班はもとより本学術領域全般の展開に寄与すると期待される。
2: おおむね順調に進展している
【動物細胞における小胞体⇔ゴルジ体連携ゾーンに関する研究】CERTは、哺乳動物細胞において、小胞体からゴルジ体へとセラミドを輸送するタンパク質である。CERTのPHドメインが有するphosphatidylinositol 4-monophosphate（PI4P）への結合能はCERTのゴルジ体会合に不可欠であり、当該PHドメイン近傍に存在する領域（SRM）が多重リン酸化修飾を受けるとCERT機能が抑制される。今回、多重リン酸化疑似10E変異を導入するとSRMがPHドメインと相互作用することを見出した。PH-SRM（10E）は非リン酸化体に比べてPI4P含有膜への結合能が減弱しており、また、PH-SRM をHeLa細胞に発現させたところ、ゴルジ体領域への同タンパク質の局在は10E変異により減弱した。SRMが多重リン酸化されるとCERTのPHドメインと相互作用して、本ドメインのゴルジ体認識能を減弱させることが明らかとなった。一方で、HAエピトープを付加したCERT（HA-CERT)を発現したHeLa細胞をSTED観察し、30-50 nmの分解能で分布を捉えられることを見出した。【植物細胞における小胞体⇔葉緑体連携ゾーンに関する研究】リン酸欠乏時の植物細胞において、リン脂質から糖脂質への膜脂質組成変化を伴いながら適応する際に、ホスファチジン酸脱リン酸化酵素PAHが必要である。今回、疑似超解像法を駆使することにより、PAHは通常生育条件下のシロイヌナズナでは主に細胞質に局在するが、リン・窒素欠乏ストレス時には葉緑体表層（内部）に多く局在するようになることがわかった。また、小胞体―葉緑体間脂質輸送が活性化されたシロイヌナズナのPAH過剰発現体では、窒素欠乏耐性が向上することも見出した。また、シロイヌナズナの疑似超解像法（分解能160 nm程度）による観察系を立ち上げた。
(1)脂質輸送に関連する小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーン形成機序 ①CERTが小胞体―ゴルジ体膜接触部位で機能するために必要な因子群を遺伝学的探索法によって見出す。②シロイヌナズナのPAH過剰発現体では野生株よりも窒素欠乏耐性が向上していることを踏まえて、PAH過剰発現を介した窒素欠乏耐性向上に寄与する新奇因子の同定を行う。また、平成30年度は特にリン・窒素欠乏時の植物体を用いてプルダウンアッセイを行い、PAHと相互作用するタンパク質を特に葉緑体膜から単離する。(2) 小胞体⇔ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンの超解像イメ－ジング解析 ①HeLa細胞においてゴルジ（GM130）、小胞体（PDI）、CERTを3重染色し、3色をクロストーク無しで、60-80 nmの解像度でSTED観察する条件を昨年度までに決めた。平成30年度は、この染色法を用いて、CERTの細胞内局在を解析する。植物細胞では、シロイヌナズナの葉緑体運動に関わるアクチン繊維を疑似超解像で観察する条件を平成29年度に決めたので、平成30年度はこの手法をPAHの局在解析に広く適用する。(3) 小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンが生存戦略に果たす役割 ①CERTが小胞体―ゴルジ体間セラミド輸送を仲介するには小胞体膜タンパク質VAPと会合が必要である。ヒト細胞にはVAP-AとVAP-Bと呼ばれる二つのアイソフォームがあり、その両方にCERTは結合する。HeLa細胞でVAP-AとVAP-Bの両方を完全欠失すると致死もしくはそれに準ずることを昨年度まで見出したので、今後は誘導型VAP欠失変異細胞株の作製を行う。②小胞体―葉緑体間の脂質輸送の活性化がこれらオルガネラでの脂質ターンオーバーを促進する可能性を検証する。
プレスリリース①化学工業日報 2017.11.14 「窒素欠乏環境の植物育成 リン脂質分解酵素必須」②日経産業新聞 2017.11.22 「植物の窒素欠乏時に耐性 新たな酵素発見」アウトリーチ活動①哺乳動物細胞における膜脂質のオルガネラ間選別輸送, 花田賢太郎, 東京工業大学・オープンセミナー, 2017/12/22. ②「細胞展」への画像提供, 加藤薫, JT生命誌研究館. その他、7件
すべて 2018 2017 その他
すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件) 備考 (3件)
Scientific Reports
巻: 8 ページ: 4381
org/10.1038/s41598-018-22707-w
巻: 7 ページ: 16814-
10.1038/s41598-017-16967-1
Frontiers in Plant Science
巻: 8 ページ: 1847-
10.2289/fpls.2017.01847
http://www.plantmorphogenesis.bio.titech.ac.jp/~official/
https://www.niid.go.jp/niid/ja/from-biochem/3257-2013-02-25-06-28-53.html
https://staff.aist.go.jp/k-katoh/labo/k-katoh.html
