| 研究領域 | 細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読 |
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| 研究課題/領域番号 |
17H06420
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
中野 明彦 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 副センター長 (90142140)
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| 研究分担者 |
黒川 量雄 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 専任研究員 (40333504)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| キーワード | 超解像ライブイメージング / GPIアンカー選別ゾーン |
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| 研究実績の概要 |
小胞体とゴルジ体の積荷蛋白質の選別輸送ゾーン、とくに出芽酵母をモデルとしたGPIアンカー型蛋白質の輸送ゾーンの解明を目指して解析を行っている。小胞体からゴルジ体への輸送はCOPII小胞が担っており、小胞体上のER exit site (ERES)と呼ばれる領域に集積する。昨年度までに、非制限温度下で小胞体からゴルジ体への輸送が阻害される温度感受性損傷をもつ変異株sec31-1株を用いることで、GPIアンカー型蛋白質Gas1とCwp2が、細胞内に多数あるERESのうちの一部のERESの近傍に集積する一方、膜貫通ドメインを持つ非GPIアンカー型蛋白質Axl2とMid2は、小胞体内腔に広く分布することを示し、GPIアンカー型と非GPIアンカー型の蛋白質が小胞体内で異なるゾーンに選別されることを明らかにした。本年度は異なる蛍光蛋白質で標識したGas1とMid2を用いて、小胞体からゴルジ体への輸送が回復した際のERESへの取り込みに着目した。SCLIMを用いた3次元ライブイメージングにより、Gas1とMid2が異なるERESに取り込まれることを示した。出芽酵母では、GPIアンカー型蛋白質はGPIアンカーが小胞体内の修飾酵素群により段階的に修飾され、成熟して小胞体からゴルジ体へと輸送される。これらの修飾酵素の欠損株では、Gas1はERES近傍に集積せず、小胞体内腔に広く分布するようになった。ある修飾酵素の多重変異株では、GPIアンカーの修飾が正常に起きないにもかかわらず、Gas1が細胞膜まで輸送された。この株ではGas1とMid2が共に小胞体全体に分布した。さらにこれらの蛋白質のERESへの取り込みを解析したところ、Gas1とMid2が同時に同じERESへ取り込まれることが判明し、小胞体におけるGPIアンカー型蛋白質の選別制御機構に関する重要な知見が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までの研究により、新規に合成されたGPIアンカー型積荷蛋白質と非GPIアンカー型積荷蛋白質が小胞体内の異なるゾーンへと選別されることを明らかにした。本年度は、異なるゾーンに選別された積荷タンパク質が、細胞内に多数あるERESにどのように取り込まれるのかをSCLIMによる3次元ライブセルイメージングにより解析した。その結果、小胞体からゴルジ体の輸送の阻害により小胞体の異なるゾーンに局在したGPIアンカー型積荷蛋白質Gas1と非GPIアンカー型積荷蛋白質Mid2は、輸送を回復させるとそれぞれ異なるERESへと取り込まれることが可視化された。このことから異なる小胞体ゾーンに選別された積荷蛋白質がERESへの取り込みにおいても選別されることが明らかになり、小胞体における積荷タンパク質の選別輸送ゾーンが明確になった。そこで次に、GPIアンカー型蛋白質のERES近傍集積の機構に迫るために出芽酵母の変異株を用いて解析を進めた。GPIアンカー型蛋白質は小胞体内の修飾酵素群によりGPIアンカーが段階的に修飾される。GPIアンカーの修飾酵素の変異株群では、GPIアンカー型蛋白質Gas1のGPIアンカーが正常に修飾されないことを生化学的なアッセイにより確認し、Gas1局在を解析した。するとGPIアンカー型蛋白質Gas1はERES近傍へ集積せず、非GPIアンカー型蛋白質と同様に小胞体内腔全体へ局在することが判明した。さらに小胞体－ゴルジ体間の輸送を回復させると、小胞体全般に局在するようになったGPIアンカー型蛋白質Gas1が、非GPIアンカー型蛋白質Mid2と共に同じERESへと取り込まれることも明らかになり、小胞体内でのGPIアンカー型蛋白質の選別輸送の制御機構を明らかにできた。以上のことから、本年度の研究は順調に進展していると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度までの研究で、小胞体で新に合成された出芽酵母のGPIアンカー型蛋白質と非GPIアンカー型蛋白質が異なる小胞体領域に選別され、その後、異なるERESに選別されて取り込まれることを明らかにした。さらに昨年計画したGPIアンカー修飾酵素変異株を用いた解析により、小胞体でのGPIアンカー型蛋白質Gas1のERES近傍への局在化と選別的なERESへの取り込みがGPIアンカーの修飾で制御されていることも明らかにした。GPIアンカーの修飾酵素が小胞体の異なる領域に局在することもわかってきている。またGas1のGPIアンカーは最終的にC26セラミドとなり成熟する。そこで、今後は段階的に働く修飾酵素群局在の関連性やGas1の選別輸送ゾーン制御と脂肪酸の長さの関連についても解析を行い、小胞体とERESでの積荷タンパク質選別の制御機構の解析を進める。また、通常の膜貫通領域を持つ非GPIアンカー型蛋白質と同様にGPIアンカー型蛋白質もERESに一旦濃縮することが示唆された。さらにゴルジ体cis槽のハグアンドキスによる積荷タンパク質の受け取りが、異なる積荷蛋白質により時間的な制御を受けていることを示唆するデータも取れ始めている。GPIアンカー型蛋白質と非GPIアンカー型蛋白質が異なるERESに集積した後、ゴルジ体のcis槽が選択的に接近、接触して積荷を受け取るのかなど、SCLIMを用いたライブイメージングによって詳細に比較、解析することで、空間的な選別機構、時間的な選別機構に迫っていく。本研究は今後もスペインセビリア大学のManuel Muniz教授の協力を得て進めていく。
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