細胞内分解システムの構造学的解析

2007 年度 実績報告書

• 研究領域: タンパク質分解による細胞・個体機能の制御
• 研究課題/領域番号: 18076003
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 杤尾 豪人 京都大学, 工学研究科, 准教授 (70336593)
• 研究分担者: 山口 芳樹 独立行政法人理化学研究所, 糖鎖構造生物学研究チーム, チームリーダー (90323451) ; 野田 展生 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教 (40396297) ; 栗本 英治 名古屋市立大学, 大学院・薬学研究科, 助教 (90234575)
• キーワード: ユビキチン / オートファジー / 構造生物学 / 溶液NMR / Xさ洙結晶構造解析

研究概要

京都大学・杤尾
p62 UBAの結晶構造を決定した。UBAは通常単量体であるが、p62 UBAは結晶中で二量体を形成していた。また、p62 UBAとユビキチンの相互作用をNMR滴定実験にて検討した結果、UBAダイマーは一度モノマーに解離し、モノマーのUBAがユビキチンと結合することを明らかにした。また、ポリュビキン鎖と相互作用が知られるRAP80のタンデムUIMの発現コンストラクトを作成し、タンパク質の調製を行なった。この試料とK63リンクのジュビキチンとの複合体をゲル濾過で大量調製することに成功した。複合体の結晶化条件のスクリーニングを開始した。同試料のPRE(Paramagnetic relaxation enhancement)-NMR測定を行ない、一方のUIMがジュビキチンの片方のユビキチンにのみ結合していることを明らかにした。
理化学研究所(前任地・名古屋市立大学)・山口、名古屋市立大学・栗本
ペプチド:N-グリカナーゼ(PNGase)について、NMR解析および糖鎖との相互作用解析を行った。その結果、PNGaseのPUBドメインはhHR23のUb1ドメインと相互作用することを見出した。NMR解析より明らかとなった相互作用部位はp97のC末領域との結合部位とは異なることから、PUBドメインはp97のC末領域およびhHR23-Ub1と同時に相互作用することが示唆された。この他、糖鎖ライブラリーを利用してPNGaseのレクチンドメインと糖鎖との相互作用解析を行い、その糖鎖認識特異性を明らかとした。
北海道大学・野田(旧姓・鈴木)
Atg12-Atg5結合体がAtg8系において新規E3様の役割を担っていることを、in vitroの再構成系を用いて酵母および植物の両方について明らかにした.また酵母Atg12-Atg5結合体についてはAtg16との複合体を調製、結晶化し、その立体構造をX線結晶構造解析で明らかにした.Atg12はC末端グリシンを介したイソペプチド結合以外に、保存された疎水性面を介してAtg5と相互作用しており、三者複合体は安定でコンパクトな構造を取っていることが明らかとなった.

研究成果

• [雑誌論文] In vitro reconstitution of plant ATG8 and ATG12 conjugation systems essential for autophagy. (2008)
  • 著者名/発表者名: Fujioka Y, Noda NN, Fujii K, Yoshimoto K, Ohsumi Y, Inagaki F.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 283 ページ: 1921-1928
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of a chaperone complex that contributes to the assembly of yeast 20S proteasomes. (2008)
  • 著者名/発表者名: Yashiroda H, Mlzushima T, Okamoto K, Kameyama T, Hayashi H, Kishimoto T, Niwa S, Easahara M, Kurimoto E, Sakate E, Takagi K.
  • 雑誌名: Nature struct. Mol. Biol. 15 ページ: 228-236
  • 査読あり
• [雑誌論文] Paramagnetic relaxation-based 19F MRI probe to detect protease activity. (2008)
  • 著者名/発表者名: Mizukami S, Takikawa R, Sugihara F, Hori Y, Tochio H, Walchli M, Shirakawa M, Kikuchi K.
  • 雑誌名: J Am Chem Soc. 130 ページ: 794-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Kinetic and thermodynamic evidence for flipping of a methyl-CpG binding domain on (2008)
  • 著者名/発表者名: Inomata K, Ohki I, Tochio H, Fujiwara K, Hiroaki H, Shirakawa M.
  • 雑誌名: Biochemistry 47 ページ: 3266-71
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Atgl2-Atg5 conjugate has a novel E3-like activity for protein lipidation in autophagy. (2007)
  • 著者名/発表者名: Hanada T, Noda NN, Satomi Y, Ichimura Y, Fujioka Y, Takao T, Inagaki F, Ohsumi Y.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 282 ページ: 37298-37302
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fbsl protects the malfolded glycoproteins from the attack of peptide: N-glycanase (2007)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Y, Hirao T, Sakata E, Kamiya Y, Kurimoto E, Yoshida Y, Suzuki T, Tanaka K, Kato K.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun 362 ページ: 712-716
  • 査読あり
• [学会発表] In-Cell NMR Spectroscopy of Proteins inside Xenopus laevis Oocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Tochio H., Sakai T., Tenno T., Tanaka T., Hiroaki H., Shirakawa
  • 学会等名: 48th Experimental NMR conference
  • 発表場所: Daytona Beach, USA
  • 年月日: 20070422-27
• [学会発表] Crystallographic and NMR analyses of the novel 20S proteasome assembling chaperone PAC3 (2007)
  • 著者名/発表者名: Kenta Okamoto, et. al.
  • 学会等名: 日本生物物理学会第45回年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-22
• [学会発表] 構造生物学的アプローチによる20Sプロテアソームサブユニットの集合過程の解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 岡本健太, ら
  • 学会等名: 平成19年度日本薬学会東海支部例会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 2007-12-08
• [学会発表] ユビキチンリガーゼgp78とE2の相互作用のNMR解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 武本映美, ら
  • 学会等名: 平成19年度日本薬学会東海支部例会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 2007-12-08
• [学会発表] 細胞表層における糖鎖認識の構造基盤:超高磁場NMRと糖鎖ライブラリーによるアプローチ (2007)
  • 著者名/発表者名: 加藤晃一, ら
  • 学会等名: 第29回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2007-11-25
• [学会発表] 20SプロテアソームのアッセンブリーシヤペロンPAC3の結晶構造 (2007)
  • 著者名/発表者名: 岡本健太, ら
  • 学会等名: 第7回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2007-05-26