生体・人工発動分子によるエネルギー変換過程の１分子計測法の開発

2020 年度 実績報告書

• 研究領域: 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計
• 研究課題/領域番号: 18H05424
• 研究機関: 分子科学研究所
• 研究代表者: 飯野 亮太 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)
• 研究分担者: 笠井 倫志 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (20447949)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2023-03-31
• キーワード: １分子計測 / 分子モーター / 光学顕微鏡

研究実績の概要

(1) A01-1班の金原、公募班の内橋と協力し、生体分子や人工分子のリンカーを用いて2量体化したリニア発動分子キネシンの運動運動特性や協調性を計測した。タンパク質リンカーであるSpyTag-SpyChatcherシステムを用いて2量体化したキネシンが、微小管上を左巻きらせん状にステップ運動することを明らかにした。らせんのピッチは160 nmであり、先行研究で報告されている非従来型キネシンのらせん運動のピッチ（230 nm）よりも大幅に小さいことが明らかとなった。また、人工リンカーであるPEG誘導体で2量体化したハイブリッドキネシンが直進運動することを明らかにした。
(2) 異方的な環境場である生体膜でエネルギー変換を行う回転型生体発動分子V-ATPaseの高速高精度１分子計測を行った。イオンの輸送が回転運動の律速となる変異体の作製に成功し、イオン輸送を担うVo部分のステップ運動を可視化することに初めて成功した。また、ATPを分解するV1部分とVo部分の両方が回転の律速となる条件での１分子計測に成功し、V1とV1のカップリングは比較的硬く、１回転当たりのイオン輸送とAT分解の比が非整数になっていることを明らかにした。さらに、A01-2班が創成した非天然型V1-ATPaseの１分子複合計測を行い、天然型が有しないアロステリ―を非天然型分子が示す機構を明らかにした。
(3) A01-1班が合成した、人工イオンチャネルの動作機構を解明するため、生体膜中での会合体数を調べ、リガンド刺激の有無で比較したが、刺激によって会合体数に大きな変化は見られなかった。蛍光タンパク質を改変したイオンプローブを複数観察したが、S/Nが足りないため、30Hzで時間変化を追跡するためには光学系の更なる改善が必要と考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(1) 非常に短いピッチでらせん運動を行う非天然2量体化キネシンの創生に成功し、運動素過程の解明に成功した。また、人工合成分子で繋いだ2量体化キネシンがプロセッシブに直進運動することを明らかにした。
(2)　イオン輸送が遅いV-ATPase変異体の作製し、V-ATPaseのVo部分のイオン輸送律速の回転ステップの可視化に成功した。また、V1部分とVo部分のエネルギー変換のカップリングは比較的硬く、１回転当たりに輸送されるイオンの数と分解されるATPの数が非整数となることを明らかにした。さらに、非天然型V1-ATPaseのアロステリ―の機構を１分子計測で明らかにした。
(3) 人工イオンチャネルは、リガンド刺激で会合体数が大きく変化しないことが明らかとなったが、ダイナミクスは不明であるので解明に取り組む。

今後の研究の推進方策

(1) リニア型生体発動分子のキネシンは２量体であり、２つの足が協調してレールである微小管上を歩く。しかし、足の繋ぎ方を変えた場合や足の数が増えた場合に協調性がどう変化するのか、運動特性がどう変化するのかは不明な点が多い。今後は、昨年度に得られた非天然2量体化キネシンの運動特性の更なる改善を試みる。また、3量体以上のキネシンの人工多量体を作製し、その運動素過程や多足間の協調の仕組みを明らかにする。さらに、A01-1班と連携し、人工分子を用いて多量体化したハイブリッドキネシンの高速高精度１分子計測法を開発する。
(2) 今後は、回転型生体発動分子V-ATPaseの１分子複合計測に取り組む。まず、変異体よりも回転速度が高い野生型V-ATPaseの運動素過程を解明する。また、マイクロデバイスと組み合わせた複合計測によるイオン輸送の素過程の可視化に取り組む。さらに、A01-2班と連携し、2倍のイオンを輸送する非天然型V-ATPaseの創生と１分子計測に取り組む。
(3) 発動分子の作動機構を解明するため、人工発動分子として、引き続き、A01-1班が作製した人工イオンチャネルを詳しく調べる。また、生体発動分子としては、新たにC01-2班が作製した変異GPCRを１分子で調べる。そのため、GPCRの活性を測定する新たなイメージング手法を開発する。膜電位や膜周辺の環境を捉えるプローブの探索と改変も行う。

研究成果

• [雑誌論文] 生きものが機械でもいいじゃない (2021)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 雑誌名: 生物物理 巻: 6 ページ: 1-1
  • DOI: 10.2142/biophys.61.077
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 銀, 金, 銀金合金ナノ粒子の光散乱を利用したマルチカラー生体１分子追跡 (2021)
  • 著者名/発表者名: 安藤潤，飯野亮太
  • 雑誌名: フォトニクスニュース 巻: 6 ページ: 132-136
  • 査読あり
• [雑誌論文] Combined approach to engineer a highly active mutant of processive chitinase hydrolyzing crystalline chitin (2020)
  • 著者名/発表者名: Visootsat A, Nakamura A, Wang T-W, Iino R
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 5 ページ: 26807-26816
  • DOI: 10.1021/acsomega.0c03911
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Domain architecture divergence leads to functional divergence in binding and catalytic domains of bacterial and fungal cellobiohydrolases (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakamura A, Ishiwata D, Visootsat A, Uchiyama T, Mizutani K, Kaneko S, Murata T, Igarashi K, Iino R
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 295 ページ: 14606-14617
  • DOI: 10.1074/jbc.RA120.014792
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High-speed single-molecule imaging reveals signal transduction by induced transbilayer raft phases (2020)
  • 著者名/発表者名: Koyama-Honda I, Fujiwara TK, Kasai RS, Suzuki KGN, Kajikawa E, Tsuboi H, Tsunoyama TA, Kusumi A.
  • 雑誌名: J. Cell Biol. 巻: 219 ページ: e202006125
  • DOI: 10.1083/jcb.202006125
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Synergetic roles of Formyl Peptide Receptor 1 oligomerization in ligand-induced signal transduction (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishiguchi T, Yoshimura H, Kasai RS, Fujiwara TK, Ozawa T
  • 雑誌名: ACS Chem. Biol. 巻: 15 ページ: 2577-2587
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00631
  • 査読あり
• [雑誌論文] A synthetic ion channel with anisotropic ligand response (2020)
  • 著者名/発表者名: Muraoka T, Noguchi D, Kasai RS, Sato K, Sasaki R, Tabata K, Ekimoto T, Ikeguchi M, Kamagata K, Hoshino N, Noji H, Akutagawa A, Ichimura K, Kinbara K
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 11 ページ: 2924
  • DOI: 10.1038/s41467-020-16770-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 生体分子モーターを観る、壊す、創る (2021)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 新学術「生命金属科学」領域会議
  • 招待講演
• [学会発表] Watching unexpected motions of protein molecular motors (2020)
  • 著者名/発表者名: Ryota Iino
  • 学会等名: Serendipity Symposium 2020
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 生体分子モーターを観る、壊す、創る (2020)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 東北大学大学院工学研究科応用物理学セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質分子モーターを観る、壊す、創る (2020)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 東京大学大学院工学系研究科化学生命工学専攻「ハイブリッドレクチャー」
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質の基礎 (2020)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 新学術領域合同シンポジウム－ソフトロボット学と発動分子科学の境界－
  • 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy as a versatile tool to study dynamical and mechanical properties of proteins (2020)
  • 著者名/発表者名: Christian Ganser, Kimitoshi Takeda, Ryota Iino, Koichi Kato, Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [学会発表] Single-molecule analysis of rotation of Enterococcus hirae V-ATPase depending on sodium ion concentration (2020)
  • 著者名/発表者名: Akihiro Otomo, Tatsuya Iida, Hiroshi Ueno, Takeshi Murata, Ryota Iino
  • 学会等名: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [学会発表] Combination approach for identification of highly-active mutant of processive chitinase (2020)
  • 著者名/発表者名: Akasit VISOOTSAT, Akihiko NAKAMURA, Tak-Wai WANG, Ryota IINO
  • 学会等名: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [学会発表] Single-molecule analysis of artificial kinesin-1 dimers and trimers with different linker lengths (2020)
  • 著者名/発表者名: Kimitoshi Takeda, Monique Honsa, Akihiko Nakamura, Jun Ando, Ryota Iino
  • 学会等名: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [学会発表] 蛍光1分子観察法による細胞膜中の分子の動態と機能の解明：会合体形成とダイナミクス (2020)
  • 著者名/発表者名: 笠井倫志
  • 学会等名: 日本化学会秋季事業 第10会 CSJ化学フェスタ2020
  • 招待講演
• [学会発表] Single molecule observation of adhesion GPCR accumulated at the cell-cell interface (2020)
  • 著者名/発表者名: Kasai RS, Nemoto YL.
  • 学会等名: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [備考] 分子研飯野グループホームページ
  • URL: https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/index.html