| 研究領域 | ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア |
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| 研究課題/領域番号 |
18H05498
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, プロジェクトリーダー (80462779)
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| 研究分担者 |
大竹 史明 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 特任准教授 (60447373)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| キーワード | ユビキチン / プロテアソーム / p97 / ケモテクノロジー / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
本計画研究では、ユビキチン解析に特化した様々な最先端プロテオミクス解析法を確立し、領域内で開発するケモテクノロジーを利用して、ユビキチンシグナルの根幹である「ユビキチン修飾の高次構造」の直接の解析と「デコーダー分子による識別・解読機構」の解明を目的とする。
１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発（佐伯・大竹）：高深度比較プロテオーム解析法（TMT16plex/FAIMS/MS2）により、内藤班と共同でサリドマイドの副作用である血管新生阻害に関与するネオ基質を同定した。また、造血器型プロスタグランジンD合成酵素を標的としたPROTACの選択性を評価し、同PROTACの特異性が非常に高いことを明らかにした。また、林班と共同で、ユビキチン単量体に対する人工抗体（モノボディ）を取得し、従来の抗ユビキチン抗体より高親和性であること、ユビキチン化基質のプロテオミクス解析に有用であることを示した。
2．エステル連結型ユビキチン鎖の機能解析（佐伯）：鳴海班と共同で、新しいユビキチン鎖であるSer20連結型ユビキチン鎖を化学合成し、Ser20Ub鎖を認識するタンパク質をMS解析により同定した。
３．シャトル分子の機能解析および阻害剤開発（佐伯）：低濃度ホルマリン架橋とユビキチン・プロテオミクス解析を組み合わせ、RAD23Bが細胞内で認識するユビキチン化基質を網羅的に同定することに成功した。また、林班と共同でRAD23Bの機能を阻害する人工抗体のスクリーニングを開始した。
４．分岐型ユビキチン鎖形成酵素の同定（大竹）：VHL型PROTACのネオ基質にはK29/K48分岐鎖が付加されることを見出し、TRIP12がK29鎖を生成するユビキチンリガーゼであること、分岐鎖形成によりネオ基質の分解誘導が増強することを見出した（Mol Cell 2021）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
前年度までに確立した高深度比較プロテオーム解析や分岐型ユビキチン鎖の高次構造解析法を標的タンパク質分解誘導剤の解析に用いることで、サリドマイド副作用に関係するネオ基質同定やPROTAC（H-PGDS）の特異性評価、さらにVHL型PROTAC作用を増強するユビキチンリガーゼTRIP12の発見など、研究に大きな進捗がみられた。また、ケモテクノロジーを用いたユビキチンコード研究についても研究が順調に進展しており、ユビキチンやデコーダー分子RAD23Bに対する人工抗体の開発、化学合成エステル型ユビキチン鎖を用いた新規デコーダー分子候補の同定などに成功しつつある。特に、K29/K48分岐型ユビキチン鎖形成によるPROTACネオ基質の分解増強についてはMol Cell誌に発表し大きな反響を得ている。このように、本年度も当初の計画以上に研究が進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発：質量分析を用いた高深度比較プロテオーム解析法（TMT16plex/FAIMS/MS2）および前年度までに確立したユビキチン化基質の網羅的変動解析法により、研究領域内で開発された新型PROTACの選択性や作用機序をプロテオーム変動を指標として評価する（佐伯）。また、分岐型ユビキチン鎖の組成解析（Middle-down MS2）について、岡本班が開発した化学合成ユビキチンを内部標準とした絶対定量法を引き続き開発する（大竹）。これらの新しい解析技術と従来のユビキチン鎖絶対定量法を用いて、領域内の各種共同研究を実施する（佐伯・大竹）。
2．プロテアソーム経路のユビキチンデコーダー分子の機能解析：これまでユビキチン選択的シャペロンp97-UFD1-NPL4とシャトル分子がプロテアソーム基質の選別とプロテアソームへの運搬に重要であることを見出しており、上記の最先端ユビキチン・プロテオーム解析法を用いて、基質選択性、ユビキチン鎖タイプ選択性を解明する（佐伯）。また、p97のユビキチン結合コファクターUFD1-NPL4、シャトル分子RAD23A、B、UBQLNファミリーについて機能を喪失させる化学ツールを領域内で開発する（佐伯）。
３．ユビキチンリガーゼの低分子リガンド開発：研究領域内で取得されたユビキチンリガーゼ新規低分子化合物リガンドを試験管内ユビキチン化反応により評価する（佐伯）。
４．新規ユビキチンコードの機能解析：研究領域内で取得された化学合成ユビキチン鎖を用いて、質量分析を用いたデコーダー分子の探索および機能解析を実施する（佐伯）。
５．分岐型ユビキチン鎖の機能解析：分岐型ユビキチン鎖によるPROTAC増強効果の普遍性を明らかにするとともに、分岐鎖形成に関与するユビキチンリガーゼをさらに探索する（大竹）。
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