| 研究領域 | ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア |
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| 研究課題/領域番号 |
18H05504
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
岡本 晃充 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (60314233)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| キーワード | ユビキチン / 化学合成 / ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
ユビキチン化はタンパク質の翻訳後修飾としてよく知られており、プロテアソーム依存的なタンパク質分解の誘導に加えて、シグナル伝達やタンパク質の輸送などを制御する。このユビキチンの多彩な機能は、ユビキチンの構造多様性とユビキチン結合タンパク質の多様性に由来する。ユビキチン修飾には、モノユビキチン化に加えて、8種類の異なる連結様式を含むポリユビキチン鎖、混合鎖、分岐鎖が存在しており、さらに鎖長も重要な要素となるため、これらのユビキチン構造に内包された膨大な情報はユビキチンコードと称されるに至っている。しかし、その存在量や機能、役割について未知なものが多く、コードの全容は未だ不明である。その最も大きな障壁となっているのが、個々のユビキチン修飾の構造多様性・不均一性であり、定義された構造（連結様式や長さなど）をもつユビキチン鎖を調製することが困難であることが、ユビキチン研究の進展を妨げている。もし化学的に裏打ちされた正確なユビキチン鎖合成プロトコルを確立することができれば、自在にユビキチンコードを創ることが可能となり、ユビキチンコードの分子レベルでの理解が飛躍的に進展すると考えられる。
ユビキチンは、76アミノ酸からなっているため、従来のペプチド固相合成法によって一気に収率良く作成することは困難であり、また、多様なポリユビキチン鎖のコンビナトリアル合成にもフィットしない。一方で、幸いにしてユビキチンはシステインを有していないので、システイン類縁体から誘導できるアラニンもしくはグリシンのN側でユビキチンを２つのフラグメントに分割した。それらのフラグメントペプチドの合成、ケミカルライゲーションによるフラグメントの連結、ライゲーションに用いられたシステインの脱硫反応によってユビキチンを化学合成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ユビキチンの合成が終了し、合成法が確立された。この方法を用いることによって大概のユビキチンを合成することができる。最終的な目標はポリユビキチン鎖を合成することであり、もう少し時間が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ユビキチン鎖の分岐は、イソペプチド分岐箇所のe-Lys-Glyのために特別に保護された人工アミノ酸を新規に合成することによって対応する。このアミノ酸を用いた場合、各フラグメント合成の後にプロキシマルユビキチンフラグメントとディスタルユビキチンフラグメントの間をGly-Glyで結合する必要があり、これについては最新の除去可能なメルカプトエチル基をe-Lys-Glyにあらかじめ導入することで解決する。このような特殊e-Lys-Glyを適切に導入したフラグメントをあらかじめ用意しておくことによって、多様なポリユビキチン鎖をコンビナトリアルに化学合成できる。特に、構造機能解析に十分なサイズの4つのユビキチンから構成されるK48鎖およびK63鎖、K48/K63分岐鎖、K63/M1混合鎖の合成に着手する。
また、蛍光色素や光親和性標識などを部位特異的に導入したユビキチンを作製する。蛍光色素として微視的構造環境に応答するチアゾールオレンジや微視的極性環境に応答するプロダンなどを用いる。機能性蛍光色素をユビキチンの適切な位置に導入することによって、ユビキチン鎖の形成とそのフォールディングを試験管内および細胞内で可視化するとともに、脱ユビキチン化の過程もモニターできるようになると思われる。この手法を用いる場合、例えばK48を介するユビキチン間結合によって生じる近位側ユビキチンと遠位側ユビキチンの間の疎水性空間を修飾するのが有効であると考えられ、この空間に位置するアミノ酸を蛍光性人工アミノ酸に置き換えることによって、K48ユビキチン鎖形成を蛍光発光を通じて観測することができるようになる。
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