| 研究領域 | 遺伝子制御の基盤となるクロマチンポテンシャル |
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| 研究課題/領域番号 |
18H05530
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
眞貝 洋一 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20211972)
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| 研究分担者 |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| キーワード | クロマチンリモデリング / クロマチンドメイン / 核内コンパートメント |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子発現は、ヌクレオソームレベルと細胞核レベル、そしてその中間に位置する「クロマチンドメイン」や「核内コンパートメント」と呼ばれるメガベース（Mb塩基）単位のクロマチン高次構造によって多階層的に制御される。このクロマチン高次構造は細胞分化に伴って変動し、クロマチンが潜在的にもつ転写の起こりやすさ（クロマチンポテンシャル）の変化と密接な関係があると考えられる。本研究では、マウス胚性幹細胞（ES 細胞）とそれを分化させた細胞を用いて、Mb 単位のクロマチン構造を制御する因子群の機能を明らかにすることで、細胞分化を実現するクロマチンポテンシャルの分子基盤を解明することを目的とする。
２０１８年度は、以下の研究を進めた。
眞貝は、クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムがダイナミックに制御されているかを明らかにすることを目指している。今年度は、クロマチンリモデリング因子HELLS/CDCA7複合体が如何にDNAメチル化を制御するのか、その実体をin vitroで解明するために、昆虫細胞でHELLS, CDCA7, DNMT3A, 3B, 3Lを発現させるベクターを構築し、蛋白質の発現・精製系を構築した。
平谷は、Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントについて、その制御因子の網羅的探索を行い、核内コンパートメントの分子基盤を明らかにすることを目標にしている。初年度は、核内コンパートメント分布とよく相関する複製タイミングを生細胞で可視化できる実験系の構築を試みた。複製タイミングが分かっているゲノム領域にGFPを導入したES細胞株を複数樹立した結果、GFP強度の違いから、GFP挿入領域の複製タイミングが推定可能と結論できる結果を得た。次年度は、この系を使いて、核内コンパートメントの制御因子の網羅的探索を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
眞貝の担当である「クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムがダイナミックに制御されているか」を明らかにする目的で、クロマチンリモデリング因子HELLS/CDCA7複合体によるDNAメチル化制御の解析をスタートさせた。昆虫細胞で必要な因子を高発現させ、精製する系をおおよそ確立したので、in vitroでの解析を進める目途が立った。
平谷の担当である「Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントについて、その制御因子の網羅的探索を行い、核内コンパートメ ントの分子基盤を明らかにする」研究については、制御因子の網羅的探索のためのレポーターシステムの構築を試み、この実験系が意図した通りに機能することを確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1-1）昆虫細胞で産生したクロマチンリモデリング因子複合体・HELLS/CDCA7、DNAメチル化酵素Dnmt3a, 3b, 3Lを用いて、in vitro DNAメチル化におけるHELLS/CDCA7の役割をヌクレオソームを基質として検討する（眞貝）。
(1-2)HELLS/CDCA7とDnmt3a/bの機能相関を細胞株を用いて検討する（眞貝）。
（1-3）A/Bコンパートメント形成におけるH3K9メチル化酵素の役割を解析する（眞貝/平谷）。
（2-1）昨年度は細胞分化に伴う複製時期変化パターンの異なる４つのゲノム領域にGFP遺伝子をノックイン（KI）したGFP-KI型マウスES細胞を作製し、期待の持てる予備実験結果を得た。今年度は、これらのGFP-KI型ES細胞が複製に伴うコピー数に応じたGFP蛍光強度を示すかを細胞周期及びGFP強度を指標としたセルソーティングとsingle-cell Repli-seq（1細胞全ゲノムDNA複製解析法）を組み合わせて検討する。検討が順調に進めば、未分化ES細胞を用いてCRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーによる複製時期制御因子の網羅的探索を行い、核内コンパートメント制御因子の網羅的同定への足がかりを得る（平谷）。
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