計画研究
雌性生殖系列のインテグリティ構築を理解するために主に以下の研究を実施した。1）in vitro由来卵の解析：in vitro由来卵では、in vivo由来卵と比較して、ミトコンドリアの膜電位、DNAコピー数、局在に顕著な異常が認められた。single cell RNA-seq解析の結果、上記の異常を説明しうる経路も抽出された。一方、階層的クラスタリング解析により、in vitro由来卵（n=45）のうちのうち4つの卵（8.9%）は、in vivo由来卵と近い遺伝子発現プロファイルを示した。これらの卵では、in vitro由来卵で発現が低下しているある転写因子の発現が回復していることが明らかになった。2）卵巣培養系を用いた卵胞形成機構の理解：これまでにFBS添加培地で培養したマウス胎仔卵巣では卵胞形成が阻害され、卵胞形成期にエストロジェン受容体の阻害剤を添加すると、卵胞形成が回復することが示された。また、この異常の一因は培養卵巣におけるAMHの異所性発現にあることが明らかにされた。本年度は、ESR1と培養卵巣から調整したクロマチンによりChIP-qPCRを実施した。Amhの上下流各10kに存在するエストロジェン応答配列（ERE）30カ所を解析した結果、Amh転写開始点上流に存在するEREにおいて、ESR1がin vivo由来卵巣よりも培養卵巣で5倍近く濃縮して結合していることがわかった。一方、in vivoにおいても卵胞形成時にエストロジェンは存在するが、AMHの発現は誘導されないことから、in vivoではエストロジェンの機能を阻害する因子が存在すると考えられた。これについて、マウスでは胎仔肝臓から分泌されるAFPが担っている可能性を検証した。FBS添加培地にさらにAFPを添加し胎仔卵巣を培養すると、Amhの発現は抑制され卵胞形成が改善することが示された。
2: おおむね順調に進展している
本研究課題のin vitroシステムで用いる培養器材が販売停止となり、代替器材の検討に時間を要した。これまでと全く同様ではないが、代替器材は概ね選定を完了した。また、コロナ禍において研究活動が大幅に制限された。一方、卵の分子生物学的な解析が進展した。卵子形成過程における遺伝子機能喪失・機能補完法は確立され、論文掲載に至った。また、RNA-seq解析では、in vitro由来卵でいくつかの興味深い異常が認められ、検証も完了できた。これについては現在論文を投稿中である。卵胞形成機構の理解に関する研究成果についても、論文掲載に至った。
1）卵形成過程解析ツールの構築と応用：人工miRNAを用いマウス卵における遺伝子ノックダウンを実施し、卵の表現型やトランスクリプトームを比較することで、卵における遺伝子の機能を解析する。またAAVを用いて、遺伝子の機能補完を試みる。2）in vitroで産生された卵子の脆弱性の原因解明：2020年度に明らかにされたin vitro由来卵における異常なタンパク質の発現や化学物質の存在が、受精後の発生に影響するか否か、パスウェイの阻害剤や亢進剤などを利用しながらin vitro系で検証していく。また、in vitro由来卵におけるミトコンドリアの機能不全などが培養中のミトコンドリアDNAの変異によるか否かを解析する。3）in vitroで産生された卵子の発生能の非破壊的予見：CRIF法で特定の波長に対して発せられる自家蛍光の強度と胚盤胞発生率との間に相関が示唆されたため、強度によってソーティングした卵子の個体発生能を検証する。また、細胞小器官のライブイメージング用プローブなどを用いて、得られた画像を解析し、発生能解析の結果と紐付けすることで、非破壊的に発生能を予見するための技術を構築していく。4）in vitro卵子産生系のリノベーション：FBS添加培地の過不足や卵子形成に有効な因子の同定に役立てるために、化学的組成の明らかな培地（CDM）を確立していく。CDMにサイトカインやホルモン、脂質などを添加した影響を評価し、卵胞形成や卵胞成長のために必要な因子の同定と至適CDMの構築を目指していく。得られた卵巣培養用のCDMをもとに、卵胞培養用のCDMについても検討していく。
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すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 3件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (2件)
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