| 研究領域 | 配偶子インテグリティの構築 |
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| 研究課題/領域番号 |
18H05553
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| キーワード | 配偶子形成 / 生殖細胞 / シングルセル / 単一細胞 / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度は2019年度に引き続き、セルブロックの凍結切片を用いてレーザーマイクロダイセクションにより回収した単一細胞からのRNA溶出効率の改善を行った。昨年度までの課題は、溶出効率が従来法よりも格段に改善し、一旦は論文発表に適したレベルかと期待されたものの、その後の検討で、ブレがおおきく実用性に難があることが判明したことであった。今年度、細胞の可溶化後の添加物を調整するなどで、安定性が向上した。また当初、まったく想定していなかった問題として、本研究で使用してきたRNase inhibitorの一つが販売中止になった。このRNase inhibitorは他の製品と全く異なり、RNaseA等に対するポリクローナル抗体をベースにした唯一のinhibitorであった。本製品は、シングルセルレベルでの微量RNA濃度領域で、他の製品とは比べものにならない阻害活性を示してきた。したがって、本研究のcDNA増幅手法の定量性と感度は、このRNase inhibitorに大きく依存していた。このため、新たなRNase inhibitorの選定と、条件検討には難航したが、試行錯誤の結果、他のRNase inhibitor候補の添加量を標準よりもはるかに増加する工夫を行うなどして、これまでと同程度のRNaseの阻害活性を発揮する、RNase inhibitorとその添加条件の組み合わせを同定することができた。この条件で、2019年度までに行っていたcDNA増幅実験を全てやり直し、データを取り直した。RNA溶出効率の再現性を高める要素技術との相性も検討し、問題がないことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、本研究で採用していた、研究代表者が長年使用してきた高品質なRNase inhibitorの製造中止が9月に判明し、代替品の検討が難航した。最終的には十分な阻害活性を持つ製品と添加条件の組み合わせを発見することができたが、試薬を変更することになったため、2019年度までに取得したデータは全て取り直しとなった。このため、進捗状況をやや遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は、前半に研究実績の概要でも触れた、RNase inhibitorの更新によるデータの取り直しを完了させる。後半には、新たなRNA溶出法による効果を、次世代シークエンスによって検証する。現在は凍結セルブロックによる手法の検討を行っているが、さらにマウス卵巣を用いて、実際の組織で手法が動くかどうかを検討する。
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