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2019 年度 実績報告書

生命金属動態に関与するタンパク質分子の構造機能ダイナミクス研究

計画研究

研究領域「生命金属科学」分野の創成による生体内金属動態の統合的研究
研究課題/領域番号 19H05761
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

城 宜嗣  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183051)

研究期間 (年度) 2019-06-28 – 2024-03-31
キーワード生体鉄 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造解析 / ヘム鉄
研究実績の概要

1.へムを活性中心に含む根粒菌の酸素センサータンパク質FixL/FixJシステムを研究対象に、結晶ならびに溶液構造解析を行った。FixLの酸素センサードメイン(Tandem PAS domain)の結晶構造を明らかにした。酸素感知活性型と不活性型の構造比較から、二量体界面でのわずかな構造変化がATPリン酸化部位に伝達される機構を提案した。また、FixJ全長の溶液構造と細胞内での構造の差異を明らかにすることを目的に、13Cと15Nでラベルした試料を用いてin vitroとin cell NMRの測定を行っている。今年度は約70%のNMRシグナルの帰属が完了した。
2.病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのX線結晶構造解析に成功した。ヘム結合型、ヘム非結合/DNA結合型、ヘム結合/一酸化炭素(CO)結合型の構造を得て、それらの構造変化から、PefRが病原菌内でのヘム濃度を感知して転写因子として機能する分子機構を提案した。さらに、PefRは宿主のヘム分解によって産生される細胞毒COをスキャベンジするシステムとして機能していることを新たに見いだした。
3.病原菌の鉄取込みポンプ(インポーター)の溶液構造解析(低温電子顕微鏡(クライオEM))、鉄排出ポンプ(エクスポーター)のX線結晶構造解析を行った。
4.ヒトの小腸での鉄吸収で重要な機能を果たしている鉄還元酵素(Dcytb)の結晶構造を基盤に、その機能を細胞内で評価するシステムを構築している。ヒト腸管のモデル細胞であるCaco-2細胞の細胞膜にDcytbを発現させる事に成功した。また、Dcytbで還元された鉄を腸管細胞に取込む際に機能するトランスポーター(DMT1)の発現精製を開始した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1.FixL Tandem PAS domainの構造を基盤に提案した酸素感知機構を検証する必要がある。全長FixJのNMR構造解析は順調に進んでいる。
2.病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのヘム感知機構を提案したが、個々のアミノ酸残基やドメインの機能までは踏み込んでいないので、そこは検証の必要がある。
3.病原菌のヘムエクスポーターのX線結晶構造解析は順調に進んでいる。ヘムインポータのクライオEM解析は、今は測定に適した試料を作成する目的で、ナノデスク作成の条件を検討中である。
4.ヒト小腸での鉄吸収を可視化するモデル細胞の構築は順調に進んでいる。鉄トランスポーター(DMT1)の発現は確認しているが、単離精製までには至っていない。

今後の研究の推進方策

1.FixL Tandem PAS domainの構造において重要と目されるアミノ酸の変異体を作成し、その酸素感知機能を測定する。常磁性金属を活用して全長FixJのin vitro NMR構造解析を進める。同時に、in cell NMR測定の準備も進める。
2.病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのヘム感知における個々のアミノ酸残基やドメインの役割を明らかにする目的で変異体の解析を進め、感知機構を検証する。
3.病原菌のヘムエクスポーターのX線結晶構造解析を完成させ、ヘムインポーターのクライオEM用の試料を作成(ナノデスク)条件を確定させる。
4.ヒト小腸での鉄吸収のモデル細胞を用いて、Dcytbの各種変異体の機能解析や鉄錯体のキレーターの評価を行う。Dcytbに加えてDMT1の発現も試み、ヒト小腸での鉄取込むの全体像の可視化をめざす。DMT1の単離精製方を確立し、構造解析をめざす。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2019 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 2件、 招待講演 7件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] University of Liverpool/University of Leeds(英国)

    • 国名
      英国
    • 外国機関名
      University of Liverpool/University of Leeds
  • [雑誌論文] UV-Raman Characterization of a Substrate Tryptophan Bound to Human Indoleamine 2,3-Dioxygenase 12019

    • 著者名/発表者名
      S. Yanagisawa, K. Kayama, M. Hara, H. Sugimoto, Y. Shiro, T. Ogura
    • 雑誌名

      Biophys. J.

      巻: 117 ページ: 706-716

    • DOI

      https://doi.org/10.1016/j.bpj.2019.07.017

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structure of Quinol-dependent Nitric Oxide Reductase from Alcaligenes xylosoxidans by Cryo-electron microscopy2019

    • 著者名/発表者名
      C. Gopalasingam, G. Chiduza, T. Tosha, M. Yamamoto, Y. Shiro, S. V. Antonyuk, S. Muench, S. S. Hasnain
    • 雑誌名

      Sci. Adv.

      巻: 5 ページ: eaax1803

    • DOI

      10.1126/sciadv.aax1803

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Chemomechanical Coupling in the Transport Cycle of a Type II ABC Transporter2019

    • 著者名/発表者名
      K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Sugita
    • 雑誌名

      J. Phys. Chem. B

      巻: 123 ページ: 7270-7281

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.9b04356

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Missing Piece of Two-Component Signal Transduction Systems Unveiled by SEC-SAXS2019

    • 著者名/発表者名
      H. Sawai, Y. Shiro
    • 雑誌名

      SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018

      巻: - ページ: 15-16

  • [雑誌論文] Observation of Enzymatic Reactions by Time-resolved X-ray Crystallography Using Photosensitive Caged Substrate2019

    • 著者名/発表者名
      T. Tosha, M. Kubo
    • 雑誌名

      SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018

      巻: - ページ: 28-29

  • [学会発表] Dynamics of Nitric Oxide in Bacterial Cellular Systems: NO Generation and Decomposition2019

    • 著者名/発表者名
      Shiro, Y.
    • 学会等名
      Japan-BIOCEV Symposium: Macromolecules; Structure, Function and Beyond
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Dynamics of Nitric Oxide in Cellular Systems: NO Generation and Decomposition2019

    • 著者名/発表者名
      Shiro Y.
    • 学会等名
      KTJ Bioinorganic Chemistry Symposium 2019 (KTJ-BICS 2019)
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質の機能解明~生命金属科学への展開をめざして~2019

    • 著者名/発表者名
      城 宜嗣
    • 学会等名
      錯体化学会第69回討論会
    • 招待講演
  • [学会発表] ヘム蛋白質の機能を司る構造・ダイナミクスとエネルギー流:実験と理論2019

    • 著者名/発表者名
      城 宜嗣
    • 学会等名
      第57回日本生物物理学会年会
    • 招待講演
  • [学会発表] Elucidation of NO Reduction Mechanism in Soluble NO Reductase by Time-Resolved Crystallography with Photosensitive Caged Compound2019

    • 著者名/発表者名
      T. Tosha
    • 学会等名
      32nd European Crystallographic Meeting (ECM32),
    • 招待講演
  • [学会発表] 原子から細胞レベルの研究による鉄イオンの吸収メカニズムの理解と有効な鉄栄養強化食品成分の探索2019

    • 著者名/発表者名
      澤井仁美
    • 学会等名
      第92回日本生化学会大会
    • 招待講演
  • [学会発表] 病原菌の鉄獲得システムで機能するヘムセンサー蛋白質の多機能性とその構造的機序2019

    • 著者名/発表者名
      澤井仁美
    • 学会等名
      第19回日本蛋白質科学会年会/第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
    • 招待講演
  • [備考] 兵庫県立大大学院生命理学研究科細胞制御Ⅱ講座

    • URL

      https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html

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公開日: 2021-01-27  

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