生命金属動態に関与するタンパク質分子の構造機能ダイナミクス研究

2021 年度 実績報告書

• 研究領域: 「生命金属科学」分野の創成による生体内金属動態の統合的研究
• 研究課題/領域番号: 19H05761
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (70183051)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2024-03-31
• キーワード: 生体鉄 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造機能解析 / ヘム鉄

研究実績の概要

ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態（還元、吸収、輸送、貯蔵など）に関連する一連のタンパク質の構造と機能を基盤に、細胞内での鉄動態を分子から細胞のレベルで明らかにする事を目的としている。腸管上皮細胞のモデル細胞を構築するために、ヒト結腸ガン由来のCaco-2細胞に鉄還元酵素Dcytbを発現させた。食餌内に含まれると考えられる様々な有機酸、糖などの化合物を酸化鉄と共存させて、細胞内の鉄吸収を観察した結果、リンゴ酸とフルクトースが鉄吸収を促進させることがわかった。鉄、フルクトース存在下でのDcytb結晶作成を試みたが、鉄・フルクトース結合型の構造は得られなかった。
Dcytbにより還元された鉄（Fe2+）を腸管上皮細胞内に吸収する（膜輸送する）トランスポーターDMT1を、ハムスターCHO細胞の細胞膜に発現させることに成功し、ベシクル化によりそのDMT1含有の細胞膜を回収することが可能となった。
病原菌は自身の増殖に必要な鉄を得るために、宿主赤血球よりヘム（鉄ポルフィリン錯体）を奪取し取り込む。しかし、細胞内ヘムは過剰になると毒性を示すために、それを回避するためのヘム排出ポンプ（ヘムエクスポーター）を有する。その構造機能解析の研究結果を論文にまとめ投稿した（現在、rivise後の再査読中）。
鉄を活性中心に含むダイズ根粒菌の酸素センサータンパク質システムFixLJの動的構造と機能の関連を明らかにする目的で、FixJのin vitroおよびin cell NMR構造解析を行っている。今年度は詳細な構造情報を得るために常磁性ランタニドを導入したFixJを調製し、そのスペクトル測定に成功し、おおよその構造を得ることに成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Caco-2細胞を用いたヒト腸管上皮細胞をモデル細胞の構築は順調に進んでいる。Dcytbの発現とその細胞内での機能評価も可能となり、Dcytb変異体の発現もできている。Dcytbに関しては、分子レベルの研究と細胞レベルの研究を結びつけることが可能となりつつある。
DMT1は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとした発現系構築を試みてきたが、CHO細胞での発現に成功し、単離精製から構造機能解析による分子レベルでの研究推進の目処がたった。

今後の研究の推進方策

腸管上皮モデル細胞を用いてDcytbの構造機能研究を大きく展開する。変異体を用いて、鉄結合、分子内電子伝達、還元剤（アスコルビン酸）との相互作用などを検討する。また、構造柔軟性のためにX線結晶構造解析では構造を観測できなかったC末端の６０残基の役割を明らかにする。他のタンパク質との相互作用部位と期待している。さらに、このモデル細胞へのDMT1の発現も試み、細胞を用いたDMT1機能解析の準備をする。DMT1の分子構造を得るために、CHO細胞から作成したベシクルからの単離精製のプロトコールを確立する。
FixJのin vivo NMR構造解析の目処はたったので、in cell NMRのための準備を開始する。

研究成果

• [国際共同研究] Ubiversity of Bristrol/University of Liverpool(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Ubiversity of Bristrol/University of Liverpool
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: H. Kwon, J. Basran, C. Pathak, M. Hussain, S. L. Freeman, A. J. Fielding, A. J. Bailey, N. Stefanou, H. A. Sparkes, T. Tosha, K. Yamashita, K. Hirata, H. Murakami, G. Ueno, H. Ago, K. Tono, M. Yamamoto, H. Sawai, Y. Shiro, H. Sugimoto, E. L. Raven, and P. C. E. Moody
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 60 ページ: 14578～14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N ₂ O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Nomura, T. Kimura, Y. Kanematsu, D. Yamada, K. Yamashita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami, T. Hisano, R. Yamagiwa, H. Takeda, C. Gopalasingam, R. Kousaka, S. Yanagisawa, O. Shoji, T. Kumasaka, M. Yamamoto, Y. Takano, H. Sugimoto, T. Tosha, M. Kubo and Y. Shiro
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 ページ: e2101481118
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatially restricted substrate-binding site of cortisol-synthesizing CYP11B1 limits multiple hydroxylations and hinders aldosterone synthesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Mukai Kuniaki、Sugimoto Hiroshi、Kamiya Katsumasa、Suzuki Reiko、Matsuura Tomomi、Hishiki Takako、Shimada Hideo、Shiro Yoshitsugu、Suematsu Makoto、Kagawa Norio
  • 雑誌名: Current Research in Structural Biology 巻: 3 ページ: 192～205
  • DOI: 10.1016/j.crstbi.2021.08.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulatory Switching by Concerted Motions on the Microsecond Time Scale of the Oxygen Sensor Protein FixL (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamawaki Takeo、Mizuno Misao、Ishikawa Haruto、Takemura Kazuhiro、Kitao Akio、Shiro Yoshitsugu、Mizutani Yasuhisa
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 125 ページ: 6847～6856
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c01885
  • 査読あり
• [学会発表] 鉄の生体内動態の分子科学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第２回レドックスR&D戦略委員会 春のシンポジウム 最先端技術が切り拓くレドックスバイオロジー
  • 招待講演
• [学会発表] Structural Basis for the Multifunctionality of the Heme-responsive Sensor Protein for Heme Detoxification in Hemolytic Bacteria (2021)
  • 著者名/発表者名: H. Sawai
  • 学会等名: 11th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP-11)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural Insights into the Multifunctionality of the Heme-responsive Sensor Protein for Detoxification in Hemolytic Bacteria (2021)
  • 著者名/発表者名: H. Sawai
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2021 (Pacifichem 2021)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明：生命金属科学への展開をめざして (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 鉄イオンの吸収に関わる膜タンパク質の構造と腸管モデル細胞を用いた機能解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 澤井仁美
  • 学会等名: 第１回トランスポーター研究会関西部会
  • 招待講演
• [学会発表] ヘムABCトランスポーターの基質輸送機構に関する分光学的解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 浅田拓也, 仲絢香, 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏
  • 学会等名: 第47回生体分子科学討論会
• [学会発表] ナノディスク再構成型BhuUV-Tによる段階的な基質輸送の分光学的観察 (2021)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 浅田拓也, 林沙英, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏
  • 学会等名: 第21回蛋白質科学会年会
• [学会発表] Structural Analyses of ABC Transporters in Nucleotide Bound States Investigated by CW-ESR Spectroscopy (2021)
  • 著者名/発表者名: 仲絢香、小堀康博、鍔木基成、城宜嗣、杉本宏、木村哲就
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 酸素バリア性フィルムを用いた嫌気条件下での一酸化窒素還元酵素反応中間体の構造解析への挑戦 (2021)
  • 著者名/発表者名: 榛葉幹治、松浦滉明、平田邦生、山本雅貴、城宜嗣、當舎武彦
  • 学会等名: 第47回生体分子科学討論会
• [学会発表] ヒト腸管細胞モデル系を用いた鉄イオンの吸収を向上させる食品成分の探索とそれらの成分が鉄輸送関連タンパク質に作用する分子機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 髙原教代、杉本宏、神戸大朋、城宜嗣、澤井仁美
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞膜超分子複合体機能解析学講座
  • URL: http://www2.riken.jp/biometal/index.htm