| 研究領域 | 「生命金属科学」分野の創成による生体内金属動態の統合的研究 |
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| 研究課題/領域番号 |
19H05774
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| キーワード | タンパク質 / ネイティブ質量分析 / 複合体 / 金属イオン / 一細胞分析 |
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| 研究実績の概要 |
以下の3項目を中心に研究を進めた。
(1) 細胞への金属イオンの取り込みや排出にもかかわる膜内トランスポーター等、膜タンパク質の構造機能解析を強力にサポートすることが可能なネイティブ質量分析による実験系の構築を行った。海洋性微生物型塩化物イオンポンプロドプシン（横浜市大・朴教授との共同研究）のネイティブ質量分析および亜鉛結合型膜内切断プロテアーゼRsePの3種類のオルソログ（横浜市大・禾准教授との共同研究）について、ネイティブ質量分析を用いてインタクトの状態の観測を試みた。その結果、ロドプシンはレチナールとの複合体のイオンを、RsePは3つのオルソログについて亜鉛結合型のイオンを、それぞれ観測することができた。
(2) 亜鉛および銅イオンが単量体当たり1個ずつ結合し二量体として機能するSOD1を研究対象として、金属結合度を定量的に解析する手法をネイティブ質量分析で検討した（領域内A02古川教授（慶応大）との共同研究）。金属イオンを完全に抜いたアポ体、そしてSOD1に対する亜鉛、銅それぞれの等量を段階的に増やして添加したホロ体の質量を、正確に測定するための試料調製および測定条件を確立した。
(3) 生細胞から直接サンプリングして、生細胞内と近い環境下でのネイティブ質量分析が可能となると、生体内での実際の分子間相互作用を観測し、そのメカニズムの解析につながる。この真の生体内分子間相互作用の解析を実現するため、未精製のタンパク質でのネイティブ質量分析を試みた。その一つとして、赤血球を一つだけサンプリングし未精製の状態でヘモグロビン四量体の観測を試みた。その結果、世界初の「一細胞ネイティブ質量分析」に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膜タンパク質のネイティブ質量分析は国内で誰も成功していない手法である。研究開始から1年足らずで亜鉛が結合した状態で膜タンパク質RsePの観測に成功したことなど、順調に進展している。また世界初の一細胞ネイティブ質量分析は、日経新聞電子版や海外の研究者のブログで取り上げられる等社会からの注目も大きな成果である。
以上から、本課題は「おおむね順調に進展」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜内プロテアーゼRsePの3つのオルソログに対して、大腸菌RsePに対し特異的に結合することが既知の薬剤との結合親和性や活性中心の亜鉛イオンの安定性等を、ネイティブ質量分析で定量的に解析することを試みる。さらに、GPCRの一つで、細胞質側に亜鉛イオンが結合することによる機能への影響が議論されているb2ARのネイティブ質量分析による解析も試みる（理研・嶋田一夫TLとの共同研究）。
SOD1が細胞質で翻訳産物として生じてから成熟型酵素となるまでのメカニズムを考察するため、SOD1の金属イオンがすべて外れたアポ体や分子内ジスルフィド結合が還元されている還元型などについてネイティブ質量分析により情報を獲得する。
ヒト培養細胞や大腸菌を用いて大量発現させたタンパク質を未精製のまま、生細胞内に近い環境下での特異的な相互作用を観測するための手法を、ネイティブ質量分析を用いて確立する。
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