生命金属動態解析を目指したタンパク質のネイティブ質量分析

2022 年度 実績報告書

• 研究領域: 「生命金属科学」分野の創成による生体内金属動態の統合的研究
• 研究課題/領域番号: 19H05774
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2024-03-31
• キーワード: タンパク質 / ネイティブ質量分析 / 複合体 / 金属イオン / 一細胞分析

研究実績の概要

以下のような研究を進めた。
1. 膜内切断亜鉛プロテアーゼRsePのネイティブMS：大腸菌大量発現系で大腸菌および海洋微生物由来のRseP（EcRsePおよびKkRseP）を調製し、インタクト及び阻害剤Batimastatとの複合体のネイティブMSによる観測を行った。ネイティブMSでは、両者の活性の違いを裏付けるかのようにKkRsePの亜鉛イオンは外れやすいのに対し、EcRsePでは外れにくいことが分かった。またBatimastatとの複合体が形成される際には、亜鉛イオンが必須であることをネイティブMSで明らかにした。（横浜市大・禾との共同研究）
2. 神経疾患に関わるヒトSOD1のネイティブMSによる解析（A02-1古川との連携研究）
SOD1は亜鉛・銅が正しく結合し活性酸素を分解する酵素として機能する。疾病との関連が報告されているSOD1変異体とSOD1野生型とのヘテロ二量体の形成は、神経疾患の発症と関わる可能性がある。そこで野生型ホモ二量体とどのような構造の違いがあるかを解析する目的で、変異体（G37R、G85R、L144F）を作成し、ヘテロおよびホモ二量体のイオンモビリティ質量分析を行い解析した。
3. 亜鉛を有する脱アセチル化酵素ヒトSirtuin 2のネイティブMSによる解析：ヒトSirtuin2 は細胞質に存在する脱アセチル化酵素で、亜鉛イオンを4つのCysが囲んで構造を安定化している。過剰に存在すると神経疾患をはじめとする様々な疾患を引き起こすことが分かっている。結晶構造では二量体を示しているものもあるが、これは結晶化によって生じた二量体とされていた。このSirt2についてネイティブMSによる解析を行ったところ、濃度依存的に単量体と二量体のピークが観測され、二量体のKdは約30μMであることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

膜タンパク質のネイティブ質量分析は計画通り進められている。特に、国内で初めての膜タンパク質RsePとその阻害剤のネイティブ質量分析に成功した。そして、領域内で城・澤井らとの共同研究で、鉄代謝に関わる膜タンパク質Dcytbのネイティブ質量分析を用いた検討にも着手できた。これ以外にも、領域内での生命金属科学の共同研究も活発に進められており、SOD1(古川らとの共同研究)の他、複数が進められていることから、順調に進展していると言える。

今後の研究の推進方策

膜タンパク質Dcytbについて、これまで結晶構造では見えていない鉄イオンとの結合に関する情報を得るべく、ネイティブ質量分析で解析する。RsePやDcytbで得られた実験結果をベースに、GPCRの解析を展開する。
SOD1の変異体と野生型のヘテロ二量体化に伴う構造変化は、ネイティブ質量分析に計算科学も組み合わせて解析を進める。
Sirtuin2は種々の変異体を調製し、機能発現と二量体化の関係について解析を進める。
生命金属の解析を一細胞で行うための手法として完成させるべく、ネイティブ質量分析の手法の高度化を図る。

研究成果

• [雑誌論文] Metal distribution in Cu/Zn-superoxide dismutase revealed by native mass spectrometry (2022)
  • 著者名/発表者名: Tajiri Michiko、Aoki Hiroto、Shintani Atsuko、Sue Kaori、Akashi Satoko、Furukawa Yoshiaki
  • 雑誌名: Free Radical Biology and Medicine 巻: 183 ページ: 60～68
  • DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2022.03.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP (2022)
  • 著者名/発表者名: Y. Imaizumi, K. Takanuki, T. Miyake, M. Takemoto, K. Hirata, M. Hirose, R. Oi, T. Kobayashi, K. Miyoshi, R. Aruga, T. Yokoyama, S. Katagiri, H. Matsuura, K. Iwasaki, T. Kato, M. K. Kaneko, Y. Kato, M. Tajiri, S. Akashi, O. Nureki, Y. Hizukuri, Y. Akiyama, T. Nogi
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 8 ページ: eabp9011
  • DOI: 10.1126/sciadv.abp9011
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hybrid in vitro/in silico analysis of low-affinity protein-protein interactions that regulate signal transduction by Sema6D (2022)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Tsubasa、Ekimoto Toru、Nagatomo Meri、Neyazaki Makiko、Shimoji Erena、Yamane Tsutomu、Kanagawa Sakura、Oi Rika、Mihara Emiko、Takagi Junichi、Akashi Satoko、Ikeguchi Mitsunori、Nogi Terukazu
  • 雑誌名: Protein Science 巻: 31 ページ: e4452
  • DOI: 10.1002/pro.4452
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cryo-electron microscopy structure of the H3-H4 octasome: A nucleosome-like particle without histones H2A and H2B (2022)
  • 著者名/発表者名: Nozawa Kayo、Takizawa Yoshimasa、Pierrakeas Leonidas、Sogawa-Fujiwara Chizuru、Saikusa Kazumi、Akashi Satoko、Luk Ed、Kurumizaka Hitoshi
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 ページ: e2206542119
  • DOI: 10.1073/pnas.2206542119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Native Mass Spectrometry of BRD4 Bromodomains Linked to a Long Disordered Region (2022)
  • 著者名/発表者名: Azegami Nanako、Taguchi Rina、Suzuki Noa、Sakata Yusuke、Konuma Tsuyoshi、Akashi Satoko
  • 雑誌名: Mass Spectrometry 巻: 11 ページ: A0110～A0110
  • DOI: 10.5702/massspectrometry.A0110
• [学会発表] 生命金属動態解析を目指したタンパク質のネイティブ質量分析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第1回生命金属科学シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 質量分析の基礎 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第8回蛋白質工学研究会ワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] 質量分析によるタンパク質複合体の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第8回蛋白質工学研究会ワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] Cu/Znスーパーオキシドディスムターゼにおける金属イオン結合機構に関するネイティブ質量分析による解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子、田尻道子、古川良明
  • 学会等名: 第22回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] ネイティブ質量分析による膜タンパク質RsePと亜鉛・阻害剤の結合状態の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 志田智哉、田尻道子，禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第70回質量分析総合討論会
• [学会発表] Gタンパク質共役受容体（GPCR）の作動薬・拮抗薬をスクリーニングするネイティブ質量分析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，今井俊輔，小沼剛、島本啓子、嶋田一夫，明石知子
  • 学会等名: 第70回質量分析総合討論会
• [学会発表] 膜内切断プロテアーゼRsePのネイティブ質量分析による特性解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 志田智哉、田尻道子，禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
• [学会発表] ネイティブ質量分析によるGタンパク質共役受容体（GPCR）の作動薬・拮抗薬スクリーニング (2022)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，今井俊輔，小沼剛、島本啓子、嶋田一夫，明石知子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
• [学会発表] メチル化DNA結合タンパク質MeCP2のH3K27me3ヌクレオソーム結合部位の同定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 牛島弘嗣，小沼剛，明石知子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
• [学会発表] ヒト培養細胞発現の直接質量分析による迅速な薬物スクリーニング手法の構築 (2022)
  • 著者名/発表者名: 鈴木のあ、坂本和香、小沼剛、明石知子
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会