| 研究領域 | 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用 |
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| 研究課題/領域番号 |
19H05783
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
山本 雅貴 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 部門長 (60241254)
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| 研究分担者 |
熊坂 崇 公益財団法人高輝度光科学研究センター, タンパク質結晶解析推進室, 室長 (30291066)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / 構造ダイナミクス / 放射光 |
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| 研究実績の概要 |
真空カメラおよびin-situ測定系について装置製作と動作検証を行い、改善点を洗い出した。
真空カメラ：前年度に判明した温度安定性の不具合を液体窒素溜と試料冷却ポット間の流路の検討で解決した。またビームラインでの使用に向けソフトウエアを含め整備した。核多角体病ウイルス由来タンパク質結晶を試料としSPring-8/BL29XULで行なった動作試験で1.5 A分解能の回折像の収集に成功し、ビームラインの測定装置として機能することを確認した。本動作試験で氷の回折に相当する分解能周辺のX線散乱強度の増大が観察された。１つの可能性である試料の温度上昇を含め、試料作成法、試料冷却ポットと試料ホルダーの密着状態等を中心とした原因究明と対処により安定な測定が可能になると考えられる。
in-situ測定系：生理活性温度環境構造解析を放射光で簡易に実施することを目的として、HAG試料雰囲気制御装置と測定法の開発を進めた。高温対応を進めた調湿装置の評価試験では20℃から40℃に昇温させつつリゾチーム結晶の回折写真を撮影することに成功し、この温度範囲で昇温に追従して相対湿度を一定に保つ性能を有することを確認した。洗い出された改良点を検討し、今後、70℃付近までの調湿に向けた装置改良と実験手法の開発を進めユーザーへの提供を目指す。また、SPring-8/BL41XUで整備するrtHAG法とSS-ROX法を組み合わせた微小結晶の室温測定法では、取得データ数に対する到達分解能の推定法の構築や、結晶コート剤のバックグランドへの影響などを評価し、これまでの結果と合わせて論文発表した。また、調湿測定に適した結晶化法の開発では結晶構造に基づいた足場タンパク質のデザインを行い、４量体ペプチド会合体のさらなる安定変異体の作成に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度は本研究専用の装置群の製作、機能検証と課題洗い出しの期間であり、想定した実験を当初計画通り完了したため。
真空カメラ開発の2020年度の目標は、オフライン性能試験と標準試料を用いたビームラインでの実証実験、バックグラウンド散乱源となる結晶付着水を結晶の質を保ちつつ可能な限り除去できる試料調製法の検討であった。オフライン試験ならびにビームラインでの実証試験で真空回折計がビームラインで使用できる測定装置として機能することを確認した。またX線入射系の見直しで更なる低バックグラウンド化が期待できることが明らかとなった。試料調製法の検討では、付着水除去効率に対する結晶懸濁液の液性の影響が小さくかつ汎用的な手法を探る試みとして、試料ホルダーを構成する窒化シリコン薄膜のグロー放電による親水化の検討を進めるなどした。対処すべき課題はあるものの、開発状況は概ね順調である。
in-situ測定系の設計製作では、これまでに開発した室温までの調温調湿装置を恒温動物の体温を含む高温側に拡張する開発を行っている。pH調整湿潤ガス発生装置の開発で利用実績のある蒸気圧の高い過熱水蒸気方式を湿潤ガスの発生に採用して開発した湿潤ガス製造装置と新たに導入したサーキュレータの組み合わせで、20-40℃までの温度範囲での調湿操作が可能であった。しかし、高温領域ではより大量の水を安定に気化するための改良と、試料吹き付け部位での窓材付近の結露への対策を行う必要があることが判明した。結晶化法については、足場タンパク質の変異体の作成と結晶解析、円二色性分光、超遠心分析、ITC、SECなどの分析により、安定な構造が得られる変異体を見出した。それらの組み合わせにより、実際の蛋白質配列にこれを付加するデザインを行った。上記の何の項目においても、想定以上の進捗がみられており、順調に推移していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度に行なった試験研究で明らかになった改善点の検討を行い、装置、測定法を一層高度化する。真空カメラの開発では、測定結晶サイズのさらなる微小化に資する高S/N比回折像の取得に向けた開発を継続する。結晶懸濁液の溶液部分の効果的な除去はバックグラウンド散乱の低減を通しS/N比向上に寄与する。試料ホルダーを構成する窒化シリコン薄膜表面の修飾法や結晶懸濁液を展開した結晶ホルダーのスピンコーターへの取り付け方法など、溶液部分の効果的な除去に向け方法を検討する。試料ホルダーの一層の温度安定化は回折像の安定な測定に寄与する。この点に関し真空回折計に装填した結晶ホルダーの残存溶媒に由来するX線散乱強度上昇の原因究明と必要に応じて試料環境に関わる部品の改造を行う。適切に整形された入射X線の利用は非結晶成分へのX線照射の低減などを通しS/N比の向上に寄与する。入射X線の良好な整形のため適切な入射光学系の検討を始める。
高温対応調温調湿装置については放射光ビームラインへの設置および動作試験を実施、この装置の試験測定を行いつつ、20－70℃昇温測定法の開発を進める。rtHAG法とSS-ROX法を組み合わせた微小結晶の室温測定法については、タイムスライス高速データ測定法の開発のため、試料の状態を評価するオンライン顕微分光装置をBL41XUに導入すると共に、今年度導入した光励起用ナノ秒OPOレーザーの光学系の構築を行い利用を開始する。これらの実験環境は、領域内研究者を中心に実験機会の提供を進めていく。また、HAG法に適した結晶化法の開発では６量体会合体の創出に加え、実際の蛋白質に付加したときの効果の評価も並行して行う。
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