時間分解構造解析を補完する精密顕微分光計測

2019 年度 実績報告書

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 19H05784
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 久保 稔 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90392878)
• 研究分担者: 木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 講師 (70506906) ; 古谷 祐詞 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80432285)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2024-03-31
• キーワード: 時間分解X線結晶構造解析 / 時間分解紫外可視吸収分光 / 時間分解赤外分光 / 時間分解ラマン分光 / 時間分解蛍光分光 / 動的構造生物学

研究実績の概要

本新学術領域の目標の一つは、時間分解結晶構造解析を軸としたタンパク質のダイナミクス研究を他分野と複合的に融合させて、タンパク質を設計・制御・操作する新しい学問領域を形成することである。そこで本研究では、時間分解結晶構造解析と時間分解分光法（紫外可視吸収、ラマン、赤外、蛍光）との相関的・補完的解析を推進し、時間分解結晶構造解析と他手法との融合の先鞭をつける。本年度は、各分光法について、タンパク質微結晶に適用できる時間分解測定技術の開発に取り組んだ。
・紫外可視吸収分光：240-700 nmの広波長範囲を測定できる時間分解顕微分光装置を開発し、新規ロドプシン微結晶の光反応観測に応用した。現在、その分光結果を参照して、時間分解結晶構造解析を進めている。今後は、DNAフォトリアーゼなど他の系へと適用範囲を拡げる。
・赤外分光：新規ロドプシン類（溶液系）の時間分解測定に成功し、光反応サイクルの速度や構造変化を観測した。また、微結晶への適用に向けて、顕微測定用の赤外分光セルを開発した。今後は、時間分解結晶構造解析との相補解析に向けて、微結晶の時間分解測定にも取り組む。
・ラマン分光：ポンプレーザーを導入し、顕微ラマン光学系を構築した。今後は、ヘム酵素をモデル試料に用いて、時間分解顕微測定系の開発を進める。
・蛍光分光：微結晶とリガンドを急速混合する二液混合ミキサーを開発し、Ca2+感受性発光タンパク質イクオリンの時間分解蛍光測定に成功した。今後は分光器を導入し、波長選択的な解析を進めるとともに、時間分解結晶構造解析の実験条件を決定する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

すべての分光法について計画通りに顕微測定系の開発が進んでいる。紫外可視吸収分光においては、すでに新規ロドプシンの系に適用し、時間分解X線結晶構造解析に進んでいる。

今後の研究の推進方策

紫外可視吸収分光においては、DNAフォトリアーゼを主たる研究対象とし、DNA光修復反応の中間体を時間分解測定で捉える。赤外分光においては、新規ロドプシン類やヘム酵素をモデルに、微結晶の時間分解測定に取り組む。またラマン分光においても、時間分解顕微測定系の開発を進める。蛍光分光においては、分光器を導入して二液混合系の顕微蛍光分光装置を完成させ、イクオリン微結晶に適用する。

研究成果

• [雑誌論文] Comparing serial X-ray crystallography and microcrystal electron diffraction (MicroED) as methods for routine structure determination from small macromolecular crystals (2020)
  • 著者名/発表者名: Wolff, A. M., Kubo, M. et al.
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 7 ページ: 306-323
  • DOI: https://doi.org/10.1107/S205225252000072X
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Syntheses, characterizations, and crystal Structures of dinitrogen-divanadium complexes bearing triamidoamine ligands. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kokubo, Y., Wasada-Tsutsui, Y., Yomura, S., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kugimiya, S., Kajita, Y., Ozawa, T., Masuda, H.
  • 雑誌名: Eur. J. Inorg. Chem. 巻: 2020 ページ: 1456-1464
  • DOI: https://doi.org/10.1002/ejic.201901123
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct measurements of ferric reductase activity of human 101F6 and its enhancement upon reconstitution into phospholipid bilayer nanodisc (2020)
  • 著者名/発表者名: El-Behery, M., Fujimura, M., Kimura, T., Tsubaki, M.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Rep. 巻: 21 ページ: 100730
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2020.100730
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Infrared spectroscopic analysis on structural changes around the protonated Schiff base upon retinal isomerization in light-driven sodium pump KR2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomida, S., Ito, S., Mato, T., Furutani, Y., Inoue, K., Kandori, H.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 巻: 1861 ページ: 148190
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2020.148190
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxidative DNA cleavage, formation of μ-1,1-hydroperoxo species, and cytotoxicity of dicopper(II) complex supported by a p-cresol-derived amide-tether ligand (2019)
  • 著者名/発表者名: Kadoya, Y., Fukui, K., Hata, M., Miyano, R., Hitomi, Y., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kodera, M.
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 58 ページ: 14294-14298
  • DOI: https://doi.org/10.1021/acs.inorgchem.9b02093
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fundamental electron-transfer and proton-coupled electron-transfer properties of Ru(IV)-oxo complexes (2019)
  • 著者名/発表者名: Kotani, H., Shimomura, H., Horimoto, M., Ishizuka, T., Shiota, Y., Yoshizawa, K., Yanagisawa, S., Kawahara-Nakagawa, Y., Kubo, M., Kojima, T.
  • 雑誌名: Dalton Trans. 巻: 48 ページ: 13154-13161
  • DOI: https://doi.org/10.1039/C9DT02734C
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pump-probe time-resolved serial femtosecond crystallography at SACLA: Current status and data collection strategies. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nango, E., Kubo, M., Tono, K., Iwata, S.
  • 雑誌名: Appl. Sci. 巻: 9 ページ: 5505
  • DOI: https://doi.org/10.3390/app9245505
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] XFEL結晶構造解析と振動分光法を用いたタンパク質の動的精密構造解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 鳥取大学GSCセミナー，鳥取大学工学部附属GSC研究センター（鳥取県・鳥取市），2019年9月27日．
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質の動的構造と機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 第46回生体分子科学討論会，筑波大学大学会館（茨城県つくば市），2019年6月22日．
  • 招待講演
• [学会発表] Membrane Protein Dynamics Studied by Time-resolved Measurements (2019)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T.
  • 学会等名: Indo-Japan Joint Workshop “Frontiers in Molecular Spectroscopy: From Fundamentals to Applications in Chemistry and Biology” Nov. 1, 2019, Kobe (Japan).
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 赤外分光法によるイオンチャネルタンパク質におけるイオン-タンパク質間相互作用の研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 古谷祐詞
  • 学会等名: ISSPワークショップ「レチナールタンパク質の光機能発現の物理と化学」プログラム, 東京大学物性研究所（千葉県・柏市）, 2019年9月5日．
• [学会発表] Time-resolved FTIR spectroscopy for studying molecular mechanisms of sodium and lithium ion transportation of Krokinobacter rhodopsin 2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Tomida, S., Kandori, H., Furutani, Y.
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [学会発表] Characterization of Antarctic inward proton pumping microbial rhodopsins (AntRs) (2019)
  • 著者名/発表者名: Harris, A., Tomida, S., Schubert, L., Lazaratos, M., Watt, E., Hoang, A., Bondar, A.-N., Heberle, J., Furutani, Y., Kandori, H., Brown, L.
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [学会発表] Structural features of enzyme rhodopsins revealed by infrared spectroscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Watari, M., Ikuta, T., Hutamata, H., Yamada, D., Shihoya, W., Yoshida, K., Furutani, Y., Tsunoda, S., Nureki, O., Kandori, H.
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [備考] 名古屋工業大学 古谷研究室ホームページ
  • URL: http://biophys-molsci.web.nitech.ac.jp/index.html