超音波・磁場感受性レシーバ分子開発と筋組織形成促進技術への応用

2020 年度 実績報告書

• 研究領域: 生体分子工学と低物理エネルギーロジスティクスの融合による次世代非侵襲深部生体操作
• 研究課題/領域番号: 20H05758
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
• 研究期間 (年度): 2020-10-02 – 2023-03-31
• キーワード: 深部生体操作 / 光熱変換 / 超音波 / 磁場 / 低物理エネルギーロジスティクス

研究実績の概要

本計画研究では、超音波や磁場に高感度で応答する新規レシーバ分子を開発し、さらにそれによってイオンチャネルを駆動することで、低物理エネルギーを生理機能に変換するシステムを構築する。そして最終的にそれらを用いた筋細胞の分化誘発の達成を目指す。
2020年度はこのうち磁場操作のため、細菌由来の巨大径機械受容チャネルであるMscLへ、細胞内に普遍的に存在し、巨大鉄ナノ微粒子を内包するフェリチンを、フェリチン結合ドメイン（FBD）を介して結合させる分子系の開発を行った。これによりMscL－フェリチンの二次元ネットワークを形質膜上に形成し、フェリチンをレシーバ分子として、磁場印可に伴う膜曲率の変化とMscLのチャネルの開口を起こすことが期待される。このうちFBD結合ドメインと融合させたMscLについては細胞内膜系への蓄積が見られたことから、今後シグナル配列などを最適化する必要がある。またフェリチンの動態を観察するためmCherryを結合させたコンストラクトを作製したところ、細胞内に良好なタンパク質の発現が見られた。
また計測系として磁場刺激を組み込んだ実験専用のパッチクランプシステムを構築し、特に磁場刺激実験に最適化した細胞還流チャンバーを設計・自作した。また物性研究所国際超強磁場科学研究施設と共同し、新たに多重巻きコイルを用いたパルス磁場印可システムを構築した。これにより最大80ミリテスラ程度のミリ秒磁場パルスを試料ステージ上に印可できることが確認され、過去の先行研究で用いられたものよりも、はるかに高い磁場勾配を用いた磁場操作が今後可能になると期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2020年度は磁場操作のため、細菌由来の巨大径機械受容チャネルであるMscLへ、細胞内に普遍的に存在し、巨大鉄ナノ微粒子を内包するフェリチンを、フェリチン結合ドメイン（FBD）を介して結合させる分子系の開発を行った。MscL－フェリチンの二次元ネットワークを形質膜上に形成し、フェリチンをレシーバ分子として、磁場印可に伴う膜曲率の変化とMscLのチャネルの開口を起こすことが期待される。このうちFBD結合ドメインと融合させたMscLについては細胞内膜系への蓄積が見られたことから、今後シグナル配列などを最適化する必要がある。またフェリチンの動態を観察するためmCherryを結合させたコンストラクトを作製したところ、細胞内に良好なタンパク質の発現が見られた。
また計測系として磁場刺激を組み込んだ実験専用のパッチクランプシステムを構築し、特に磁場刺激実験に最適化した細胞還流チャンバーを設計・自作した。また物性研究所国際超強磁場科学研究施設と共同し、新たに多重巻きコイルを用いたパルス磁場印可システムを構築した。これにより最大80ミリテスラ程度のミリ秒磁場パルスを試料ステージ上に印可できることが確認され、過去の先行研究で用いられたものよりも、はるかに高い磁場勾配を用いた磁場操作が今後可能になると期待される。

今後の研究の推進方策

次年度以降、シグナル配列の最適化などによって形質膜上へのMscL-FBDの良好な発現が見られた段階で、内在性フェリチンと結合させ、さらにパルス磁場の印可によるイオン流の測定をパッチクランプ法で行う。得られる電流が弱い場合は、FBDの種類を変えるなどの検討を行う。また超音波操作についても、今後超音波発生装置をパッチクランプシステムに組み込み、MscLやPIEZO1などを発現させた細胞を用いて、超音波で誘起される電流の観測を試みる。

研究成果

• [雑誌論文] TAT Rhodopsin is a UV-Dependent Environmental pH Sensor (2021)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Kataoka, Teppei Sugimoto, Shunta Shigemura, Kota Katayama, Satoshi P. Tsunoda, Keiichi Inoue, Oded Beja, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 60 ページ: 899-907
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00951
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Exploration of Natural Red-shifted Rhodopsins Using a Machine Learning-based Bayesian Experimental Design (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Masayuki Karasuyama, Ryoko Nakamura, Masae Konno, Daichi Yamada, Kentaro Mannen, Takashi Nagata, Yu Inatsu, Hiromu Yawo, Kei Yura, Oded Beja, Hideki Kandori, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: 362
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01878-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Time-Resolved Serial Femtosecond Crystallography Reveals Early Structural Changes in Channelrhodopsin (2021)
  • 著者名/発表者名: K. Oda, T. Nomura, T. Nakane, K. Inoue, S. Ito, J. Vierock, ... R. Ishitani, S. Hayashi, H. Kandori, P. Hegemann, S. Iwata, M. Kubo, T. Nishizawa, O. Nureki
  • 雑誌名: eLife 巻: 10 ページ: e62389
  • DOI: 10.7554/eLife.62389
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Crystal Structure of Schizorhodopsin Reveals Mechanism of Inward Proton Pumping (2021)
  • 著者名/発表者名: Akimitsu Higuchi, Wataru Shihoya, Masae Konno, Tatsuya Ikuta, Hideki Kandori, Keiichi Inoue, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 118 ページ: e2016328118
  • DOI: 10.1073/pnas.2016328118
  • 査読あり
• [雑誌論文] Schizorhodopsins: A Novel Family of Rhodopsins from Asgard archaea that Function as Light-Driven Inward H+ Pumps (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Satoshi P. Tsunoda, Manish Singh, Sahoko Tomida, Shoko Hososhima, Masae Konno, Ryoko Nakamura, Hiroki Watanabe, Paul-Adrian Bulzu, Horia L. Banciu, Adrian-Stefan Andrei, Takayuki Uchihashi, Rohit Ghai, Oded Beja, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 6 ページ: eaaz2441
  • DOI: 10.1126/sciadv.aaz2441
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Gate-Keeper of Ion Transport- a Highly Conserved Helix-3 Tryptophan in a Channelrhodopsin Chimera, C1C2/ChRWR (2020)
  • 著者名/発表者名: Yujiro Nagasaka, Shoko Hososhima, Naoko Kubo, Takashi Nagata, Hideki Kandori, Keiichi Inoue, Hiromu Yawo
  • 雑誌名: Biophysics and Physicobiology 巻: 17 ページ: 59-70
  • DOI: 10.2142/biophysico.BSJ-2020007
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Excitonic Coupling Effect on the Circular Dichroism Spectrum of Sodium-Pumping Rhodopsin KR2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro J. Fujimoto, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: The Journal of Chemical Physics 巻: 153 ページ: 45101
  • DOI: 10.1063/5.0013642
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Active Learning of Bayesian Linear Models with High-Dimensional Binary Features by Parameter Confidence-Region Estimation (2020)
  • 著者名/発表者名: Yu Inatsu, Masayuki Karasuyama, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Neural Computation 巻: 32 ページ: 1998-2031
  • DOI: 10.1162/neco_a_01310
  • 査読あり
• [雑誌論文] Active Learning for Level Set Estimation Under Input Uncertainty and Its Extensions (2020)
  • 著者名/発表者名: Yu Inatsu, Masayuki Karasuyama, Keiichi Inoue, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Neural Computation 巻: 32 ページ: 2486-2531
  • DOI: 10.1162/neco_a_01332
  • 査読あり
• [雑誌論文] Shining light on rhodopsin selectivity: How do proteins decide whether to transport H+ or Cl-? (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 295 ページ: 14805-14806
  • DOI: 10.1074/jbc.H120.016032
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression Analysis of Microbial Rhodopsin-like Genes in Guillardia theta (2020)
  • 著者名/発表者名: Masae Konno, Yumeka Yamauchi, Keiichi Inoue, Hideki Kandori
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 ページ: e0243387
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0243387
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] タンパク質のボトムアップ機能向上への機械学習法の応用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: ISSPワークショップ「物性科学におけるデータ科学の今と未来」
  • 招待講演
• [学会発表] Photobiology of new microbial rhodopsins (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: BPS - Biophysical Society 65th Annual Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 新奇な微生物型ロドプシンの光機能およびその光反応メカニズム (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第3回晝間輝夫光科学賞・令和2年度研究助成金贈呈式
  • 招待講演
• [学会発表] Sir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world of microbial rhodopsins in photobiology (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: MPI-FKF Seminar
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Sir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world of microbial rhodopsins in photobiology (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: MRC LMB Seminar
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光駆動型内向きプロトンポンプ、シゾロドプシンのプロトン輸送メカニズム (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 光駆動型内向きH+ポンプ型シゾロドプシンのH+輸送メカニズムの分光及び構造研究 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第46回討論会
• [学会発表] 海洋性細菌のCl-ポンプロドプシンにおける波長制御メカニズムの変異体解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇、烏山 昌幸、中島 悠、吉澤 晋、竹内 一郎、井上 圭一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第46回討論会
• [学会発表] TATロドプシンのpKaと多量体形成の制御における保存されたグルタミン酸の役割 (2020)
  • 著者名/発表者名: 萬年 健太郎、永田 崇、戸叶 貴也、内橋 貴之、Oded Beja、井上 圭一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第46回討論会
• [学会発表] 微生物ロドプシンの吸収波長の自在制御に向けた機械学習法の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 日本バイオインダストリー協会・発酵と代謝研究会勉強会
  • 招待講演
• [学会発表] アスガルド古細菌の持つ新奇光駆動型内向きプロトンポンプ、シゾロドプシンの輸送メカニズム (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 日本化学会 第101春季年会 (2021)
• [図書] Optogenetics: Light-Sensing Proteins and Their Applications in Neuroscience and Beyond (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 総ページ数: 37
  • 出版者: Springer Nature
  • ISBN: 978-981-15-8763-4
• [備考] 東京大学物性研究所・井上研究室
  • URL: https://inoue.issp.u-tokyo.ac.jp/index.html