超音波・磁場感受性レシーバ分子開発と筋組織形成促進技術への応用

2021 年度 実績報告書

• 研究領域: 生体分子工学と低物理エネルギーロジスティクスの融合による次世代非侵襲深部生体操作
• 研究課題/領域番号: 20H05758
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
• 研究期間 (年度): 2020-10-02 – 2023-03-31
• キーワード: 深部生体操作 / 光熱変換 / 超音波 / 磁場 / 低物理エネルギーロジスティクス

研究実績の概要

本計画研究では、超音波や磁場に高感度で応答し、イオン輸送を行う新規レシーバ分子を開発し、さらにそれによってイオンチャネルを駆動することで、低物理エネルギーを生理機能に変換するシステムを構築する。そして最終的にそれらを用いた筋細胞の分化誘発の達成を目指す。2021年度はこのうち磁場操作のため、PIEZO1やTRPV4のほか、細菌由来の巨大径機械受容チャネルであるMscLへ、細胞内に普遍的に存在し巨大鉄ナノ微粒子を内包するフェリチンを、フェリチン結合ドメイン（FBD）を介して結合させる分子系の開発を行った。さらにフェリチンとMscLにそれぞれFRB、FKBPタグを導入することで、ラパマイシンを用いて分子間の結合を誘導するコンストラクトの作製も行った。これらのコンストラクトのイオン輸送能を効率的に評価するため、細胞に陰圧を加えた際に生じるイオン流を測定するパッチクランプ系を新たに構築した。これにより設計したPIEZO1、MscLのコンストラクトが、野生型に近い機械受容能と整流性のないイオン輸送活性を保持していることを確認した。特にMscLについては単一チャネルコンダクタンスがおよそ0.7nS程度と大きなものであり、効率的な磁場操作を可能にするものとして期待される。
さらに磁場刺激法について、新たに20mT程度の高周波磁場を印加できる系を構築し、より多様な形での磁場刺激を可能とした。そのほかフェリチンとチャネルの結合をより正確に評価するため、全反射蛍光顕微鏡を用いた一分子顕微鏡の構築を行い、一分子レベルで細胞表面の分子の観察が可能であることを確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2021年度は磁場操作のため、PIEZO1やTRPV4のほか、細菌由来の巨大径機械受容チャネルであるMscLへ、細胞内に普遍的に存在し巨大鉄ナノ微粒子を内包するフェリチンを、FBDもしくはFRB-ラパマイシン-FKBPを介して強固に結合させるコンストラクトの作製も行った。またこれらコンストラクトが異なる機械受容チャネルの輸送能を効率的に評価するため、新たに構築した陰圧刺激型のパッチクランプこれにより、設計したPIEZO1、MscLのコンストラクトが、野生型に近い機械受容能とイオン輸送活性を保持していることを確認した。さらに磁場刺激法について、新たに20mT程度の高周波磁場を印加できる系を構築し、より多様な形での磁場刺激を可能とした。そのほかフェリチンとチャネルの結合をより正確に評価するため、全反射顕微鏡の構築を行い、一分子レベルで細胞表面の分子の観察が可能であることを確認した。
以上のことから、本年度予定されていた研究項目は概ね達成することができ、順調な研究の進展が見られた。

今後の研究の推進方策

本年度複数のコンストラクトについて、良好なチャネル活性が見られ、また高強度パルス、高周波、定常など異なる形での磁場刺激が可能な系の構築も完了したことから、次年度においてはこれらを用いて、実際に細胞の活動を制御することを試みる。磁場印加によるイオン流の変化が少ない場合は、新たに構築した一分子観察系を用いて、イオンチャネルへのフェリチンの結合を評価し、それを指針に最も強いフェリチンの結合が可能な分子設計を行っていく。

研究成果

• [雑誌論文] Diverse Heliorhodopsins Detected via Functional Metagenomics in Freshwater Actinobacteria, Chloroflexi and Archaea (2022)
  • 著者名/発表者名: Ariel Chazan, Andrey Rozenberg, Kentaro Mannen, Takashi Nagata, Ran Tahan, Shir Yaish, Shirley Larom, Keiichi Inoue, Oded Beja, Alina Pushkarev
  • 雑誌名: Environmental Microbiology 巻: 24 ページ: 110-121
  • DOI: 10.1111/1462-2920.15890
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Basis for Channel Conduction in the Pump-like Channelrhodopsin ChRmine (2022)
  • 著者名/発表者名: K. E. Kishi, Y. S. Kim, M. Fukuda, T. Kusakizako, E. Thadhani, E. F. X. Byrne, J. M. Paggi, C. Ramakrishnan, T. E. Matsui, K. Yamashita, T. Nagata, M. Konno, P. Y. Wang, M. Inoue, T. Benster, T. Uemura, K. Liu, M. Shibata, N. Nomura, S. Iwata, O. Nureki, R. O. Dror, K. Inoue, K. Deisseroth, H. E. Kato
  • 雑誌名: Cell 巻: 185 ページ: 672-689.e23
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.01.007
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Characterization of Proton-pumping Rhodopsin Lacking a Cytoplasmic Proton Donor Residue by X-ray Crystallography (2022)
  • 著者名/発表者名: Kano Suzuki, Maria del Carmen Marin, Masae Konno, Reza Bagherzadeh, Takeshi Murata, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 298 ページ: 101722
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.101722
  • 査読あり
• [雑誌論文] Saccharibacteria Harness Light Energy Using Type-1 Rhodopsins That May Rely on Retinal Sourced from Microbial Hosts (2022)
  • 著者名/発表者名: Alexander L. Jaffe, Masae Konno, Yuma Kawasaki, Chihiro Kataoka, Oded Beja, Hideki Kandori, Keiichi Inoue, Jillian F. Banfield
  • 雑誌名: The ISME Journal 巻: オンライン公開 ページ: オンライン公開
  • DOI: 10.1038/s41396-022-01231-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Thermostable Light-Driven Inward Proton Pump Rhodopsins (2021)
  • 著者名/発表者名: Yuma Kawasaki, Masae Konno, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: Chemical Physics Letters 巻: 779 ページ: 138868
  • DOI: 10.1016/j.cplett.2021.138868
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ion transport activity assay of microbial rhodopsin expressed in Escherichia coli cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Masae Konno, Keiichi Inoue, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 11 ページ: e4115
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.4115
  • 査読あり
• [雑誌論文] Microbial Rhodopsins: The Last Two Decades (2021)
  • 著者名/発表者名: Andrey Rozenberg, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Oded Beja
  • 雑誌名: Annual Review of Microbiology 巻: 75 ページ: 427-447
  • DOI: 10.1146/annurev-micro-031721-020452
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Pro219 is an Electrostatic Color Determinant in the Light-driven Sodium Pump KR2 (2021)
  • 著者名/発表者名: Yuta Nakajima, Laura Pedraza-Gonzalez, Leonardo Barneschi, Keiichi Inoue, Massimo Olivucci, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: 1185
  • DOI: 10.1038/s42003-021-02684-z
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Heliorhodopsin Evolution is Driven by Photosensory Promiscuity in Monoderms (2021)
  • 著者名/発表者名: Paul-Adrian Bulzu, Vinicius Silva Kavagutti, Maria-Cecilia Chiriac, Charlotte D. Vavourakis, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Adrian-Stefan Andrei, Rohit Ghai
  • 雑誌名: mSphere 巻: 6 ページ: e00661-21
  • DOI: 10.1128/mSphere.00661-21
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Rhodopsins at a Glance (2021)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagata, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 134 ページ: jcs258989
  • DOI: 10.1242/jcs.258989
  • 査読あり
• [学会発表] 光ではたらく膜タンパク質 ―ロドプシンの多彩な機能と光遺伝学― (2022)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第6回CURIEセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 細菌由来新奇Cl-ポンプロドプシンの輸送メカニズム研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 石塚智大、川﨑佑真、今野雅恵、井上 圭一
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会関東支部会
• [学会発表] レチナール光異性化酵素ロドプシンRGRの光吸収・反応特性の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 森本直也、永田崇、井上 圭一
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会関東支部会
• [学会発表] Study on the dynamics of channel opening and closing of cation channelrhodopsin, C1C2 (2022)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue、Keisei Shibata、 Kazumasa Oda、Tomohiro Nishizawa、Yuji Hazama、Ryohei Ono、Shunki Takaramoto、Reza Bagherzadeh、Hiromu Yawo、Osamu Nureki、Hidefumi Akiyama
  • 学会等名: 日本化学会 第102春季年会（2022）
• [学会発表] 機械学習を用いたロドプシンの吸収波長予測法とオプトジェネティクスツール開発への応用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一、烏山昌幸、神取秀樹、竹内一郎
  • 学会等名: ISSPワークショップ：開放系トポロジーと生体・量子・統計物理
• [学会発表] レチナール光異性化酵素として働くロドプシンの光吸収・反応特性の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 森本直也、永田崇、井上圭一
  • 学会等名: ISSPワークショップ：開放系トポロジーと生体・量子・統計物理
• [学会発表] 光駆動タンパク質ロドプシンのもたらす生物と光の新たな関係 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: バイオインダストリー協会"・未来へのバイオ技術" 勉強会「光と音の遺伝子応答とオプトジェネティクス」
  • 招待講演
• [学会発表] アスガルドアーキア由来の新奇光駆動型内向きプロトンポンプ：シゾロドプシンの機能・分光・構造研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 第47回生体分子科学討論会
• [学会発表] Methanoculleus 属アーキア由来シゾロドプシンの熱安定性研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上圭一
  • 学会等名: 第47回生体分子科学討論会
• [学会発表] ロドプシンの色を変える：構造・理論・機械学習的アプローチ (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 電気学会 光・量子デバイス研究会「革新的材料の創出とデバイス応用」
  • 招待講演
• [学会発表] 光エネルギーを使って内向きにプロトンを輸送するロドプシンの構造とダイナミクス (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会・ワークショップ「高速分子動画：タンパク質の構造機能相関研究の最先端」
  • 招待講演
• [学会発表] Methanoculleus 属古細菌由来新奇シゾロドプシンの熱安定性評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上圭一
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] アスガルドアーキアは光をつかう？―ロドプシンを用いた光受容と新奇シゾロドプシンファミリ― (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 極限環境生物学会・第22回シンポジウム「微生物ダークマターへの挑戦」
  • 招待講演
• [学会発表] 自然界の光分子ツールボックス―微生物ロドプシンの科学を理解する― (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第19回 “光”機到来！Ｑコロキウム
  • 招待講演
• [学会発表] 高温環境由来新奇シゾロドプシンの熱安定性研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上圭一
  • 学会等名: 第15回分子科学討論会
• [学会発表] 真核生物の起源に関わる新奇光受容型膜タンパク質ロドプシンの機能メカニズム研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 山田科学振興財団・2021年度研究交歓会
  • 招待講演
• [学会発表] 高温環境から発見されたシゾロドプシンの熱安定性研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上圭一
  • 学会等名: 第11回CSJ化学フェスタ2021
• [学会発表] DTGロドプシンのX線結晶構造解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一、鈴木花野、今野雅恵、Reza Bagherzadeh、Andrey Rozenberg、Maria del Carmen Marin、Oded Beja、村田武士
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
• [学会発表] 視覚再生に向けた暗活性・光不活性化GPCR型光遺伝学ツールの開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] シグナルペプチドを持つMarine group II 古細菌由来Clade-Cロドプシンの分子特性 (2021)
  • 著者名/発表者名: 今野雅恵、Bu Xu、Apoorva Prabhu、Yang Liu、Meng Li、Oded Beja、Chuanlun Zhang、Christian Rinke、Lu Fan、井上圭一
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
• [学会発表] Color Tuning of Microbial Rhodopsin Proteins: Combined Spectroscopic and QM/MM Modeling Studies (2021)
  • 著者名/発表者名: Maria del Carmen Marin Perez、Konno Masae、Laura Pedraza-Gonzalez、Luca De Vico、Massimo Olivucci、Keiichi Inoue
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
• [学会発表] 高温環境由来のアーキアから発見されたシゾロドプシンの熱安定性研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上 圭一
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
• [学会発表] レチナール光異性化酵素として働く動物ロドプシンの分光学的解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 森本直也、永田崇、井上 圭一
  • 学会等名: 第59回生物物理学会年会
• [学会発表] 機械学習による微生物ロドプシンの吸収波長予測 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一、烏山昌幸、神取秀樹、竹内一郎
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Color Tuning of Microbial Rhodopsin Proteins: Combained Spectroscopic and QM/MM Modeling Studies (2021)
  • 著者名/発表者名: Maria del Carmen Marin Perez、今野雅恵、Laura Pedraza-Gonzalez、Luca De Vico、Massimo Olivucci、井上圭一
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
• [学会発表] The diversity and the molecular mechanism of light-driven inward proton pump rhodopsins (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pachific Basin Societies (Pacifichem) 2021
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Red-shifting mutation of light-driven sodium-pump rhodopsin (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue、Maria del Carmen Marin Perez、Sahoko Tomida、Ryoko Nakamura、Yuta Nakajima、Massimo Olivucci、Hideki Kandori
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pachific Basin Societies (Pacifichem) 2021
  • 国際学会
• [学会発表] Detection of Functional Processes of Photoreceptive Proteins by Muon (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Tamiko Kiyotani, Ichiro Tanaka
  • 学会等名: ISIS Muon Illumination Workshop
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular physiological study on rhodopsin-based visual and non-visual photoreceptions of a jumping spiser (2021)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇
  • 学会等名: 日本比較生理生化学会第43回札幌大会
  • 招待講演
• [学会発表] Spectral characterization of vertebrate opsins acting as a retinal photoisomerase (2021)
  • 著者名/発表者名: 森本直也、永田崇、井上圭一
  • 学会等名: 日本比較生理生化学会第43回札幌大会
• [備考] 東京大学物性研究所・井上研究室
  • URL: https://inoue.issp.u-tokyo.ac.jp/index.html