| 研究領域 | マルチファセット・プロテインズ：拡大し変容するタンパク質の世界 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05930
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
松本 雅記 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60380531)
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| 研究期間 (年度) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| キーワード | プロテオミクス / プロテオゲノミクス / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
近年、未知のオープンリーディングフレームの発見や非典型的な翻訳開始や終結などが多数見出されており、実際のプロテオームはより複雑でこれまでの常識の範囲の中では探し出せないタンパク質を多数含んでいる可能性が高い。本研究では、さまざまな先端技術を取り入れることで新たなプロテオゲノミクスの枠組みである『仮説駆動型プロテオゲノミクス解析基盤』を創出を目指す。今年度は、未開拓プロテオームを同定するための手法として、RiboSeq-DIA法を確立した。領域内の他の計画班等で得られたRiboSeqデータを活用し、様々な翻訳パターンによって生じることが期待される予測ORFを含むfastaファイルを作成した。これらのfastaファイルを用いて気相分画や塩基性pH逆相分画法とDIAを組み合わせた高深度プロテオームデータを解析することで新規タンパク質を同定を試みた。得られたタンパク質配列をPcPG-DBに取り込み、DNA情報と照合することで翻訳産物のアノテーションを実施した。また、得られた新規ORF配列に対して、内部標準ペプチドの連結体をデザインし、前年度開発したQuantiCodeベクターシステムに組み込んだ。HeLa細胞などの典型的ながん細胞株に適用した。さらに、内部標準トリガーで超高感度測定モードに切り替える質量分析計測法であSureQuantを大規模に実施できるようDIA法で未検出ペプチドに対するSureQuantメソッドを自動作成するツールを開発した。これらの解析の結果、新規ORFに対するペプチドが多数同定されたが、その多くはプロテオミクスで広く利用されているトリプシンによる非特異的な切断の可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでに大規模な複数の細胞株に対して高深度プロテオームデータを取得して、これをRiboSeqによって得られた新規ORF配列データベースを用いて解析を実施したが、その結果を詳細に解析した結果、プロテオーム解析で一般に使われているtrypsinによる非特異的切断によって多くの新規ORF由来配列が説明できることが判明し、単純な高深度解析だけで新規ORFの実像を把握することは困難であることが判明した。このため、これまで構築した手法を活用しつつも新しい研究戦略を取ることが必要であると判断し、その開発に着手したため、全体的に計画が遅延している。
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| 今後の研究の推進方策 |
Trypsin消化による単純なショットガンプロテオミクスでは、trypsinの非特異的切断が混じってくるため真の新規ORFの発見は困難である。この問題を解決するために、trypsinの消化特異性を挙げるための方策やタンパク質のN末端を特異的に検出する手法の導入などを検討する。Trypsinは自己消化で生じたpseudo -trypsinがchymotrypsin様活性を持つことが知られている。そのため各種化学修飾を施すことで自己消化を低減させたtrypsinなどを比較評価を行う。またN末端解析法は多数の手法が報告されているが、網羅性や感度の問題があまり高くない。既出の方法や独自の手法などを検討し、最も効率の良い方法を選択するとともに、網羅性や感度を改善するための工夫を諸々検討する。具体的には利用する酵素の種類の検討やデータ解析の手法を新規に開発を実施する。
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