| 研究領域 | ＤＮＡの物性から理解するゲノムモダリティ |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05937
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
西山 朋子 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (90615535)
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| 研究期間 (年度) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| キーワード | クロマチン高次構造形成 / コヒーシン |
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| 研究実績の概要 |
長大なDNAをいかにして微小な核内に収納させるのかは、真核生物における重要な問いである。その一つの答えはヒストンによるDNAの巻き付けであるが、それに対し近年、DNAループ形成という全く異質のDNA構造がクロマチン高次構造形成に重要であることが分かってきている。このDNAループ形成を司ると考えられているのが、原核生物からヒトまで保存されているSMC（structural maintenance of chromosomes）タンパク質複合体である。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構造を作りあげる仕組みを解明することを目指す。とくにコヒーシンが作るDNAループ構造に着目し、その形成メカニズムを明らかにする。初年度である2020年度はin vitro 一分子DNAループ形成解析系の構築と使用するタンパク質の精製に着手した。ヒトのコヒーシン複合体と、そのローディングに必要なコヒーシンローダーNIPBL/Mau2複合体を昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を用いて発現、精製し、これらのタンパク質複合体で、全反射顕微鏡を用いて、DNAループ形成が一分子レベルで観察できる系を構築した。DNAループ形成におけるコヒーシンの機能を明らかにするために、コヒーシンとDNAが接触する可能性の高いアミノ酸残基、およびコヒーシン病で報告のあるアミノ酸残基を手がかりに、これらの残基に変異を導入したコヒーシン複合体のDNAループ形成能を検証する予定である。このためのコンストラクションおよびタンパク質精製、これらの変異体を発現する培養細胞の作製に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究で用いる全ての複合体遺伝子はMulti-Bacを用いた発現系で発現・精製する。Multi-Bacの作製は複数の遺伝子を1つの巨大なプラスミドに組み込む方法で行われるため、通常のプラスミド作製よりも時間を要する。初年度は複数の変異体のコンストラクト作製および、系の構築を行う予定であった。一分子ループ押出し系の構築やコンストラクト作製、発現細胞作製に着手しており、おおむね順調と判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異体の発現、精製、蛍光標識をすすめ、これらの変異体の一分子DNAループ形成能を、ループ形成速度・頻度・ループ維持時間・ATPase活性を指標に検証する。また、コヒーシンの分子内構造変化とループ形成機能を関連づけ、ループ形成メカニズムを明らかにするために、コヒーシン分子内FRETの系を構築する。
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