計画研究
AGOサブファミリーについては、ヒトにおけるRNAサイレンシング現象の主体であるArgonaute2 (Ago2)に着目し、そのNドメインの系統的変異導入ライブラリーを作成し、RISC形成能(二本鎖RNAのAgoへの取り込み、およびAgo内でのRNA鎖のひきはがしと一本鎖化)と標的切断能に関して定量的な解析を行った。その結果、NドメインはヒトAg2への二本鎖RNAの積み込みには必要ないものの、その後の二本鎖RNAの一本鎖化の過程において重要な役割を果たしているということがアキラかとなり、Nドメインが小分子RNA二本鎖に「くさび」を打ち込むことによって、二本のくさりを解離させるというもんでるを提唱した。また、ショウジョウバエAgo2についても、同様にNドメインに系統的変異を導入したところ、ヒトAgo2とは異なり、二本鎖RNAのAgo2への積み込み段階において異常な中間体が蓄積する様な変異体が見つかった。これは、ショウジョウバエのRISC形成に特有の素過程が存在することを示唆している。また、PIWIサブファミリーについては、カイコ培養細胞を利用し、piRNAの生合成過程の一部、すなわち長い一本鎖RNAがPIWIに取り込まれた後、3'末端が削り込まれ、さらに2'-O-Me化されるという一連の反応を正しく再現できる試験管内反応系の構築に初めて成功し、3'末端の削り込みと2'-O-Me化が共役した反応であることを示した。また、カイコSiwiやAgo3に結合するタンパク質の網羅的同定も進めた。
1: 当初の計画以上に進展している
AGOサブファミリーの系統的変異解析については、全く機能未知であったNドメインが、RISC形成過程における二本鎖RNAの引きはがしに関与することを見いだせたということ、また、それによってRISC形成過程にWedging(くさびの打ち込み)という新たな素過程の存在を提唱できた、ということから、当初の目的に従って順調に進展していると考えられる。また、ヒトとショウジョウバエのAgo2において、同じNドメインが異なる役割を担う可能性を示唆する興味深い知見も得られている。また、PIWIサブファミリーについては、Tudorドメインタンパク質を含め、piRNA経路に関与する未知因子の同定と機能解析が順調にすすんでおり、さらに、piRNA生合成過程の一部を試験管内で再現できる系の構築と、それに基づく新しいモデルの提案という、当初計画を凌ぐ成果も達成できた。以上のことから、現時点では、本研究は当初の計画以上に進展していると考えられる。
AGOサブファミリーについては、今回提唱した「くさびモデル」をさらに検証するため、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用し、Nドメインによって「くさびが打ち込まれた」状態を捉えることを試みる。すでに予備実験は開始しており、小分子RNA二本鎖の片方の末端を蛍光標識してもRISC形成には大きな影響を与えないことを確認済みである。また、このモデルの普遍性を検証するため、他のAGOサブファミリータンパク質についても変異体解析をすすめる。PIWIサブファミリーについては、確立したpiRNA生合成の試験管内再現系を最大限に活用し、piRNA生合成経路の生化学的解析を進め、piRNA前駆体の3’末端を削り込む活性を持つ「トリマー」酵素の同定を目指す。さらには、これまでにPIWIサブファミリーとの相互作用が明らかとなった多数の因子について、大規模な機能解析を進め、piRNA作用マシナリーにおける役割を明らかにする。また、領域内での連携を進め、本領域から生まれた2つの特許技術、すなわち「光学活性ホスホロチオエートRNAの合成法」と「RISC形成過程に必要なRNAの構造的特徴」を有機的に組み合わせることによる高効率なsiRNAの分子デザインに向け、光学活性ホスホロチオエートの導入位置とRISC形成効率との相関を見出すための検討を行う。
すべて 2012 2011
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (5件)
Mole Cell.
巻: 43(6) ページ: 1015-1022
10.1016/j.molcel.2011.07.029.
Nat Struct Mol Biol.
巻: 18(10) ページ: 1153-1158
10.1038/nsmb.2125.
RNA.
巻: 17(12) ページ: 2144-2151
10.1261/rna.027565.111.
EMBO J.
巻: 30(24) ページ: 4998-5009
10.1038/emboj.2011.426.
巻: 19(2) ページ: 145-151
10.1038/nsmb.2232.
