| 研究概要 |
EGFPおよびRFPとSmchd1との融合蛋白質を発現するトランスジェニックマウスを作製するにあたって,いくつかのこのとなるプロモーターの制御化に融合蛋白質遺伝子をつないだコンストラクトを構築し,最初に培養細胞で発現の様子を観察した.その結果に基づき,最も適切と思われるコンストラクトを用いて,トランスジェニックマウスをそれぞれ複数ライン作製し,その発現を胚線維芽細胞と初期胚で観察した.その結果,いずれのラインにおいても融合蛋白質の蛍光強度は期待したほど高いものではなく,着床前胚におけるX染色体の活性変化をこれらの融合蛋白質の動態で可視化することは困難と思われた.しかし,Smchd1-EGFPの発現を抗GFP抗体で観察したところ,Xist RNAとの共局在が確認されたことから,Smchd1-EGFPは期待したよりは発現量が低いものの,内在性Smchd1同様不活性X染色体に局在することが分かった.この結果は,抗GFP抗体でSmchd1-EGFPと相互作用する蛋白質を免疫沈降するのには,むしろ好都合と考え,トランスジェニックマウスの胎児細胞抽出液を用いた解析の準備を進めている.これまでに行った予備実験において,抗GFP抗体で胎児細胞抽出液からSmchd1-EGFPを免疫沈降出来ることを確認した.しかしながら,共沈降する蛋白質を確認するには至っておらず,沈降物の洗浄等に関してはまだまだ詳細な条件検討が必要である.とはいえ,Smchd1と相互作用する蛋白質を免疫沈降によって同定するための準備は整った.
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