準安定的に形成される受容体・リガンド複合体間の相互作用解析

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－
• 研究課題/領域番号: 21121002
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 嶋田 一夫 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (70196476)
• 研究分担者: 甲斐荘 正恒 首都大学東京, 公私立大学の部局等, 教授 (20137029)
• 研究期間 (年度): 2009-07-23 – 2014-03-31
• キーワード: 構造生物学 / 核磁気共鳴法 / 相互作用 / 過渡的複合体 / 転移交差飽和法

研究概要

In-cell NMR法は細胞内に導入したタンパク質のNMRシグナルを直接観測し、その構造情報を得る手法である。近年、より高等な哺乳細胞を対象としたin-cell NMR法の開発も報告されており、実際の細胞内での相互作用観測に基づく創薬スクリーニングへの応用も期待されている。しかし、高密度の細胞をNMR試料管内に充填して測定を行うin-cell NMR法では、細胞内環境の劣化および細胞死が経時的に生じるため、限られた時間内でしかNMR観測を行うことができないという問題があった。
そこで、我々は細胞内環境を保ったまま長時間のin-cell NMR測定をおこなうための新規バイオリアクターシステムの開発を行った。まず、細胞を温度可塑性のメビオールゲル内に封入した状態でNMRサンプル管に充填し、サンプル管底部から一定の速度で培地を灌流させた。31P NMR観測の結果から、通常は30分以内で枯渇する細胞内ATP濃度を、バイオリアクターを用いることで15時間以上一定に保持できることが示された。また、15時間経過後にも死細胞の増加がほとんど認められず、長時間のin-cell NMR測定が可能であることが示された。
確立した手法を用いて、外部から導入したタンパク質と内在性のタンパク質との相互作用界解析を行った。微小管結合ドメインCap-Gly domain 1 (CG1)をHeLa細胞内に導入し、内在性の微小管との相互作用部位を転移交差飽和（TCS）法により観測した。その結果、既にin vitro研究にて重要性が示されている疎水性面を相互作用部位として同定することに成功した。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of a binding element for the cytoplasmic regulator FROUNT in the membrane-proximal C-terminal region of chemokine receptors CCR2 and CCR5 (2014)
  • 著者名/発表者名: Toda E, Terashima Y, Esaki K, Yoshinaga S, Sugihara M, Kofuku Y, Shimada I, Suwa M, Kanegasaki S, Terasawa H, Matsushima K.
  • 雑誌名: Biochem J 巻: 457 ページ: 313-322
  • DOI: 10.1042/BJ20130827
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure-based approach to improve a small-molecule inhibitor by the use of a competitive peptide ligand. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ono K, Takeuchi K, Ueda H, Morita Y, Tanimura R, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: Angew Chem Int Ed Engl 巻: 53 ページ: 2597-2601
  • DOI: 10.1002/anie.201310749
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional dynamics of cell surface membrane proteins (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Osawa M, Takeuchi K, Imai S, Stampoulis P, Kofuku Y, Ueda T, Shimada I.
  • 雑誌名: J Magn Reson 巻: 241 ページ: 86-96
  • DOI: 10.1016/j.jmr.2013.11.007.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kubo S, Nishida N, Udagawa Y, Takarada O, Ogino S, Shimada I.
  • 雑誌名: Angew Chem Int Ed Engl 巻: 52 ページ: 1208-1211
  • DOI: 10.1002/anie.201207243
  • 査読あり
• [雑誌論文] Backbone resonance assignments for the cytoplasmic region of the Mg(2+) transporter MgtE in the Mg (2+)-unbound state (2013)
  • 著者名/発表者名: Maruyama T, Imai S, Osawa M, Hattori M, Ishitani R, Nureki O, Shimada I.
  • 雑誌名: Biomol NMR Assign 巻: 7 ページ: 93-96
  • DOI: 10.1007/s12104-012-9385-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the mouse sex peptide pheromone ESP1 reveals a molecular basis for specific binding to the class C G-protein-coupled vomeronasal receptor (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshinaga S, Sato T, Hirakane M, Esaki K, Hamaguchi T, Haga-Yamanaka S, Tsunoda M, Kimoto H, Shimada I, Touhara K, Terasawa H.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 288 ページ: 16064-16072
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.436782
  • 査読あり
• [雑誌論文] Backbone resonance assignments for G protein α(i3) subunit in the GDP-bound state (2013)
  • 著者名/発表者名: Mase Y, Yokogawa M, Osawa M, Shimada I.
  • 雑誌名: Biomol NMR Assign
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nuclear magnetic resonance approaches for characterizing interactions between the bacterial chaperonin GroEL and unstructured proteins. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Yagi-Utsumi M, Motojima F, Yoshida M, Shimada I, Kato K.
  • 雑誌名: J Biosci Bioeng 巻: 116 ページ: 160-164
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2013.02.012.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Backbone and side-chain (1)H, (15)N and (13)C resonance assignments of the microtubule-binding domain of yeast cytoplasmic dynein in the high and low-affinity states. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takarada O, Nishida N, Kikkawa M, Shimada I.
  • 雑誌名: Biomol NMR Assign
  • DOI: 10.1007/s10858-012-9628-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Perdeuteration and methyl-selective (1)H, (13)C-labeling by using a Kluyveromyces lactis expression system (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyazawa-Onami M, Takeuchi K, Takano T, Sugiki T, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: J Biomol NMR 巻: 57 ページ: 297-304
  • DOI: 10.1007/s10858-013-9789-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rapid identification of ligand-binding sites by using an assignment-free NMR approach (2013)
  • 著者名/発表者名: Kodama Y, Takeuchi K, Shimba N, Ishikawa K, Suzuki E, Shimada I, Takahashi H.
  • 雑誌名: J Med Chem 巻: 56 ページ: 9342-9350
  • DOI: 10.1021/jm4014357
  • 査読あり
• [学会発表] 二次元NMRインターフェログラム再構成法の開発およびCCR5のMIP-1α結合様式の解明への応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田卓見、吉浦知絵、松本昌彦、幸福裕、奥出順也、近藤啓太、白石勇太郎、嶋田一夫
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] β2-アドレナリン受容体のシグナル制御機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 幸福 裕，上田 卓見，奥出 順也，白石 勇太郎，近藤 啓太，前田 正洋，
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] NMR 法による脂質二重膜中における P2X4受容体の動的構造平衡の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 志歩，湊 雄一，幸福 裕，上田 卓見，服部 素之，濡木 理，嶋田 一夫
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] β2 アドレナリン受容体のリン酸化によるシグナル制御機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 白石 勇太郎，幸福 裕，上田 卓見，嶋田 一夫
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] 脂質二重膜中の脂質による GPCR の活性制御機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 水村 拓也、近藤 啓太、幸福 裕、上田 卓見、嶋田 一夫
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] NMR 法による P2X4 受容体の開閉制御機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 湊 雄一、鈴木 志歩，幸福 裕，上田 卓見，服部 素之，濡木 理，嶋田 一夫
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] 電位依存性カリウムイオンチャネルの膜電位感受機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 野﨑智裕, 小澤新一郎, 原田瞳, 木村友美, 大澤匡範, 嶋田一夫
  • 学会等名: 日本薬学会 第134年会
  • 発表場所: 熊本県熊本市
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] NMR observation of protein-protein interactions in living mammalian cells using a gel encapsulated bioreactor system (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田紀貴、嶋田一夫
  • 学会等名: 第36回分子生物学会年会
  • 発表場所: 兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131203-20131205
  • 招待講演
• [学会発表] イオンチャネルの機能に関連した動的構造 (2013)
  • 著者名/発表者名: 今井駿輔、○大澤匡範、三田建一郎、豊永翔、町山麻子、上田卓見、竹内 恒、老木成稔、嶋田一夫
  • 学会等名: 第35回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • 発表場所: 東京都文京区
  • 年月日: 20131121-20131123
  • 招待講演
• [学会発表] Affinity regulation mechanism of microtubule-binding domain of cytoplasmic dynein (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田紀貴、宝田理、吉川雅英、嶋田一夫
  • 学会等名: Dynein2013
  • 発表場所: 兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131101-20131103
  • 招待講演
• [学会発表] A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田紀貴、嶋田一夫
  • 学会等名: 生物物理学会 第51回年会
  • 発表場所: 京都府京都市
  • 年月日: 20131028-20131030
  • 招待講演
• [学会発表] Functional Equilibrium of GPCR (2013)
  • 著者名/発表者名: 嶋田一夫
  • 学会等名: 5th Asia-Pacific NMR Symposium in conjunction with ANZNAG2013
  • 発表場所: Brisbane, Australia
  • 年月日: 2013-10-24
• [学会発表] Functional Equilibrium of Membrane Proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: 嶋田一夫
  • 学会等名: International Conference on Structural Genomics 2013
  • 発表場所: 北海道札幌市
  • 年月日: 2013-07-24
• [学会発表] Functional Equilibrium of Membrane Proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: 嶋田一夫
  • 学会等名: 54th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • 発表場所: Asilomar, California, USA
  • 年月日: 2013-04-15
• [学会発表] Functional Equilibrium of GPCR
  • 著者名/発表者名: 嶋田一夫
  • 学会等名: Symposium “Perspectives of NMR in drug discovery
  • 発表場所: Novartis, Basel, Switzerland
  • 招待講演
• [学会発表] NMR を用いた高分子量タンパク質複合体の相互作用解析法の開発と応用
  • 著者名/発表者名: 嶋田一夫
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 兵庫県神戸市
  • 招待講演
• [備考] 東京大学大学院薬学系研究科 生命物理化学教室
  • URL: http://ishimada.f.u-tokyo.ac.jp/public_html/index_j.html