In situ計測による脂質、膜受容体の活性化機構の解明

2010 年度 実績報告書

• 研究領域: 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－
• 研究課題/領域番号: 21121006
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 白川 昌宏 京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)
• 研究分担者: 森川 耿右 大阪大学, 蛋白質研究所, 特任研究員 (80012665)
• キーワード: In-cell NMR / 19F NMR / 細胞生物学 / FKBP12 / FK506 / ラパマイシン

研究概要

我々はこれまでに、細胞内にある状態での、タンパク質のNMRスペクトルやESRスペクトルを取得し解析する手法を開発してきた。また、この「In-cell NMR/ESR法」によって細胞内タンパク質の分子間相互作用、プロセッシング、運動性・安定性が原子レベルで解析可能であることを示してきた。本研究ではこれら手法を中心として、細胞内や細胞表層で形成される過渡的なたんぱく質複合体のその場(in situ)観察・解析のための手法を開発する。本年度は、フッ素^<19>FのNMRを用いたHeLa細胞でのIn-cell NMRの開発を重点的に行なった。我々は、これまで、^1H-^<15>N HMQC法を用いてIn-cell NMRを行なっていたが、二次元測定のため測定に時間がかかるという難点があった。^<19>Fによる部分標識を行なうことにより、一次元測定でもNMRシグナルを分離でき、そのため、測定時間の短縮が可能となる。まず、モデルタンパク質として、FKBP12を用い、そのフェニルアラニン(Phe)残基をp-フルオロフェニルアラニン(^<19>F-Phe)としたタンパク質を調製した。これを我々が開発したTAT-Ubタグを用いてHeLa細胞内に導入し、細胞を回収後、NMR測定を行なった。FKBP12には合計五つの^<19>F-Pheがあるが、当該In-cell ^<19>F NMRスペクトル中に、これら五つのNMRシグナルを観測することができた。本手法により測定時間および細胞の量が、ともに従来の半分以下でも十分に解析可能なスペクトルを得ることができた。さらに、FKBP12と相互作用するとされる免疫抑制剤FK506およびラパマイシンとの相互作用を細胞内で検出することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Distance Determination in Proteins inside Xenopus laevis Oocytes by Double Electron-Electron Resonance Experiments. (2010)
  • 著者名/発表者名: Igarashi R, Sakai T, Hara H, Tenno T, Tanaka T, Tochio H, Shirakawa M.
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 132 ページ: 8228-8229
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for regulation of poly-SUMO chain by a SUMO-like domain of Nip45. (2010)
  • 著者名/発表者名: Sekiyama N, Arita K, Ikeda Y, Hashiguchi K, Ariyoshi M, Tochio H, Saitoh H, Shirakawa M.
  • 雑誌名: Proteins : Structure Function and Bioinformatics 巻: 78 ページ: 1491-1502
  • 査読あり
• [雑誌論文] Solution structure of a zinc-finger domain that binds to poly-ADP-ribose (2010)
  • 著者名/発表者名: Isogai, S., Kanno, S.I., Ariyoshi, M., Tochio, H., Ito, Y., Yasui, A., Shirakawa, M.
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 15 ページ: 101-110
  • 査読あり
• [雑誌論文] Purification, crystallization and preliminary crystallographic studies of Lys48-linked polyubiquitin chains (2010)
  • 著者名/発表者名: Morimoto, D., Isogai, S., Tenno, T., Tochio, H., Shirakawa, M., Ariyoshi, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F 巻: 66 ページ: 834-837
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure and Mutagenesis Studies of the C-terminal Region of Licensing Factor Cdt1 Enable the Identification of Key Residues for Binding to Replicative Helicase Mcm Proteins (2010)
  • 著者名/発表者名: Jee, J., Mizuno, T., Kamada, K., Tochio, H., Chiba, Y., Yanagi, K., Yasuda, G., Hiroaki, H., Hanaoka, F., Shirakawa, M.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 285 ページ: 15931-15940
  • 査読あり
• [学会発表] Plenary lecture (2010)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Shirakawa
  • 学会等名: APRU research symposium
  • 発表場所: Kyoto University, Japan(招待講演)
  • 年月日: 2010-11-24