Ｉｎ ｓｉｔｕ計測による脂質、膜受容体の活性化機構の解明

2012 年度 実績報告書

• 研究領域: 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－
• 研究課題/領域番号: 21121006
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 白川 昌宏 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00202119)
• 研究分担者: 森川 耿右 公益財団法人国際高等研究所, その他部局等, 名誉教授 (80012665)
• 研究期間 (年度): 2009-07-23 – 2014-03-31
• キーワード: NMR / 脂質シャペロン / 脂肪酸結合蛋白質

研究概要

脂肪酸シャペロン・FABP4の脂肪酸輸送機構の解明を目指してダイナミクスと機能の関連を解析した。FABP4を15N標識し、NMR緩和時間測定（T1T2({１H}―15Nへテロ核NOE)を行い、モデルフリー解析により回転相関時間と化学交換寄与及びオーダーパラメータを求めた。主鎖15核のT1/T2の値から、FABP4のヘリックス-ループ-ヘリックス領域(HLH領域)が基質非結合状態においてマイクロ秒～秒時間スケールでゆらいでいることが示唆された。
一方、基質であるANSを結合させると、HLH領域のRexが顕著に抑制され、新たにRexを有するようになる残基が多く存在することがわかった。さらに、FABP4 3-fluorotyrosine で標識したもののNOESY測定を行った結果、Tyr19の位置に挿入された19F間は二状態あり、その間に交換ピークが観測された。これは、HLH領域の構造のゆらぎによるものと考えられた。
また、in-cell NMRスペクトルから、FABP4はHeLa細胞内ではアポ体であることが示唆された。
Toll様受容体(TLR)の細胞内シグナルに関しては、リニア型ユビキチン鎖のin vitroでの物性解析を行った。熱変性実験の結果、モノユビキチンとユビキチン鎖では、熱安定性が異なることが分かった。すなわち、ユビキチン鎖の鎖長が長くなるに従って、変性温度が低下した。また、水溶液を攪拌し、剪断力を与えると、ユビキチン鎖が容易に沈殿し、繊維化することを見出した。一方で、モノユビキチンを同様の条件で攪拌してもこのような繊維化は起こらなかった。現在、細胞内環境下でも試験管内で見られたようなユビキチン鎖の繊維化が起こるのかどうかを検証している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の構想通り、15N標識FABP4を調製し、これをTAT配列を用いてHeLa細胞に導入することによって、そのin-cell 1H-15N HMQCスペクトルの取得に成功した。このスペクトルから、細胞内でのFABP4の状態（リガンド結合の有無など）について情報を得ることができ、FEBP4はアポ体で存在することが示唆された。
TLRの研究については、下流のシグナル伝達に重要なポリユビキチン鎖について興味深い性質を見出した。すなわち、ユビキチン鎖による線維形成である。これに関して、様々な物理化学的測定を行い、その物性を評価した。ユビキチン鎖の繊維化は、全く新規のものであり、ユビキチン関連分野に大きなインパクトを与えるものと思われる。

今後の研究の推進方策

脂肪酸シャペロン・FABP4については、脂肪細胞を用いて同様のin-cell NMR実験を行い、細胞内在性の脂質分子と結合しているかどうか、結合しているとすれば選択制があるかどうかを調べる。同時に、培養の条件によって、スペクトルがどのように変化するのかを調べる。FABP4の核内移行を促進するリガンド分子と、そうでないリガンド分子が存在することが知られている。これらとFABP4との複合体について試験管内で核スピン緩和実験を行い、FABP4の構造ゆらぎと核内移行活性の相関を調べる。また、in-cell NMR法を用いて細胞内での核スピン緩和時間測定を試み、細胞内での構造ゆらぎに関する知見を得る。
Toll様受容体(TLR)の細胞内シグナルに関してはその下流で重要な役割を果たすポリユビキチン鎖の構造や運動性の解析を進める。特に、in-cell NMRを利用し、細胞内と試験管内での構造の違いを明らかにする。これら情報と、細胞内で発生している物理的な剪断力や細胞質の粘度の情報を統合し、ポリユビキチン鎖の細胞内での状態や物性についての知見を得る。

研究成果

• [雑誌論文] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins in living insect cells using a baculovirus protein expression system. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hamatsu J, O'Donovan D, Tanaka T, Shirai T, Hourai Y, Mikawa T, Ikeya T, Mishima M, Boucher W, Smith BO, Laue ED, Shirakawa M, Ito Y.
  • 雑誌名: J Am Chem Soc. 巻: 135 ページ: 1688-1691
  • DOI: 10.1021/ja310928u
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the versatile DNA recognition ability of the methyl-CpG binding domain of methyl-CpG binding domain protein 4. (2013)
  • 著者名/発表者名: Otani, J., Arita, K., Kato, T., Kinoshita, M., Kimura, H., Suetake, I., Tajima, S., Ariyoshi, M., Shirakawa, M.
  • 雑誌名: J Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 6351-6362
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.431098
  • 査読あり
• [雑誌論文] Utilization of lysine ¹³C-methylation NMR for protein-protein interaction studies. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hattori Y, Furuita K, Ohki I, Ikegami T, Fukada H, Shirakawa M, Fujiwara T, Kojima C.
  • 雑誌名: J Biomol NMR. 巻: 55 ページ: 19-31
  • DOI: 10.1007/s10858-012-9675-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hinge and chromoshadow of HP1α participate in recognition of K9 methylated histone H3 in nucleosomes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Mishima Y, Watanabe M, Kawakami T, Jayasinghe CD, Otani J, Kikugawa Y, Shirakawa M, Kimura H, Nishimura O, Aimoto S, Tajima S, Suetake I.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 425 ページ: 54-70
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2012.10.018
  • 査読あり
• [雑誌論文] Real-time background-free selective imaging of fluorescent nanodiamonds in vivo. (2012)
  • 著者名/発表者名: Igarashi, R., Yoshinari, Y., Yokota, H., Sugi, T., Sugihara, F., Ikeda, K., Sumiya, H., Tsuji, S., Mori, I., Tochio, H., Harada, Y., Shirakawa, M.
  • 雑誌名: Nano Lett. 巻: 12 ページ: 5726-5732
  • DOI: 10.1021/nl302979d
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recognition of modification status on a histone H3 tail by linked histone reader modules of the epigenetic regulator UHRF1. (2012)
  • 著者名/発表者名: Arita K, Isogai S, Oda T, Unoki M, Sugita K, Sekiyama N, Kuwata K, Hamamoto R, Tochio H, Sato M, Ariyoshi M, Shirakawa M.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 巻: 109 ページ: 12950-12955
  • DOI: 10.1073/pnas.1203701109
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRAM is involved in IL-18 signaling and functions as a sorting adaptor for MyD88. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi H, Tochio H, Kato Z, Kawamoto N, Kimura T, Kubota K, Yamamoto T, Funasaka T, Nakano H, Wong RW, Shirakawa M, Kondo N.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 7 ページ: e38423
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0038423
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular analysis of the binding mode of Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain proteins during TLR2 signaling. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nada M, Ohnishi H, Tochio H, Kato Z, Kimura T, Kubota K, Yamamoto T, Kamatari YO, Tsutsumi N, Shirakawa M, Kondo N.
  • 雑誌名: Mol Immunol. 巻: 52 ページ: 108-116
  • DOI: 10.1016/j.molimm.2012.05.003.
  • 査読あり
• [雑誌論文] NMR analysis of Lys63-linked polyubiquitin recognition by the tandem ubiquitin-interacting motifs of Rap80. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sekiyama N, Jee J, Isogai S, Akagi K, Huang TH, Ariyoshi M, Tochio H, Shirakawa M.
  • 雑誌名: J Biomol NMR. 巻: 52 ページ: 339-350
  • DOI: 10.1007/s10858-012-9614-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of Ca2+ on the microtubule-severing enzyme p60-katanin. Insight into the substrate-dependent activation mechanism. (2012)
  • 著者名/発表者名: Iwaya N, Akiyama K, Goda N, Tenno T, Fujiwara Y, Hamada D, Ikura T, Shirakawa M, Hiroaki H.
  • 雑誌名: FEBS J. 巻: 279 ページ: 1339-1352
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2012.08528.x.
  • 査読あり
• [学会発表] Magnetic Resonance for Investigation of structure and dynamics of proteins and membranes in live cells
  • 著者名/発表者名: Shirakawa,M
  • 学会等名: The 25th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: Lyon, France
  • 招待講演
• [学会発表] In-Cell NMR Spectroscopy of Proteins Inside Living Cells
  • 著者名/発表者名: Shirakawa,M
  • 学会等名: Keystone Symposium on Frontiers of NMR in Biology
  • 発表場所: Utah, USA